血浆Spetin9甲基化对结直肠癌的诊断和治疗监测作用

余南荣 黄志良 吴成杰 鲁伟群 杨国华 徐厚巍 刘海鹰

广州医科大学附属肿瘤医院胃肠肿瘤外科（广州 510095）

结直肠癌（colorectal cancer）的发病率和死亡率近年在我国有持续升高的趋势。早发现、早诊断及早治疗成为提高结直肠癌治愈率及延长患者生存时间的关键。但目前临床中仍缺乏对结直肠癌早期诊断敏感且特异的肿瘤标志物，因此寻找更敏感和高特异性的监测指标成为临床亟待解决的问题。

Septin9基因甲基化是结直肠癌重要的生物学特征之一，其在结直肠癌患者外周血和肿瘤组织中均高表达，而在健康人群或其他结直肠疾病中呈低表达［1-2]。因此，Septin9基因甲基化有可能成为结直肠癌筛查诊断和治疗监测的一个候选标志物。但目前关于血浆甲基化Septin9在结直肠癌术后监测、预测复发、评估生存等方面的报道较少，仅有小型病例研究结果表明Septin9甲基化可用于结直肠癌术后的随访监测，并初步显示其与结直肠癌患者术后生存呈负相关。此外，虽然血浆Septin9甲基化及血清癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）在结直肠癌诊断和监测中都有重要作用，但每个指标单独作为结直肠癌的诊断和预测指标都不能准确而完整地反映病情。因此，本研究拟通过采集结直肠癌患者手术前后及化疗前后的外周血液，检测血浆Septin9甲基化及血清CEA的表达并探索二者在结直肠癌诊断、预测复发方面的作用，从而为血浆Septin9甲基化成为结直肠癌诊断及监测复发的标志物提供可靠的临床依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象及病例入组标准于2015年12月至2016年4月间入组符合以下标准的结直肠癌患者：（1）既往未接受过任何抗肿瘤治疗；（2）术后病理诊断证实为结直肠腺癌；（3）患者首次治疗为手术切除或FOLFOX方案化疗。同期收集30例我院自愿者健康人血液标本作为对照。病例剔除标准：（1）既往接受过抗肿瘤治疗的患者；（2）术后病理诊断证实为非结直肠腺癌者；（3）患者首次治为非FOLFOX方案化疗者。本研究已通过我院伦理委员会批准，所有研究对象已知情并签署知情同意书。

1.2 血浆样本的收集和保存对符合条件的结直肠腺癌病例依据治疗方式进行分组：手术组血液标本的采集时间为：手术前、手术后4周；化疗组血液采集时间为：化疗前、2次化疗后。每例血液样本均详细记录对应患者的一般资料、临床信息、病理资料等。采样时抽取10 mL/支静脉全血2支，分别以EDTA抗凝和真空无抗凝处理，用于提取血浆和血清。样本可立即用于Septin9基因甲基化和CEA测定，或保存于-20℃低温冰箱，4周内进行检测。

1.3 血清CEA蛋白和血浆Septin9基因甲基化的检测血清CEA表达水平由广州医科大学附属肿瘤医院检验科采用放射免疫荧光进行检测。采用Septin9基因甲基化检测试剂盒（PCR荧光探针法）检测血浆Septin9甲基化水平。按照试剂盒说明书步骤对血浆中DNA进行提取、磁珠结合、洗涤和亚硫酸盐转化处理，然后每个DNA样本中按比例加入相应体积的PCR反应液和PCR聚合酶（PCR Master Mix），按照常规PCR扩增进行40个热循环后读取数据结果。每次实验均设阴性和阳性对照，所有样本均进行3次重复试验。

1.4 统计学方法采用SPSS 16.0软件进行统计学分析，所有假设检验比较均为双侧，P＜0.05为差异具有统计学意义。计量资料两组组间比较采用独立样本t检验。计数资料组间比较采用行×列χ2检验。

2 结果

2.1 结直肠癌患者血浆Septin9甲基化和血清CEA的表达情况在2015年12月至2016年4月间共收集符合条件的结直肠癌血浆样本35例和健康人群血浆样本30例。35例患者中，治疗前血浆Septin9甲基化阳性表达26例，阴性表达9例，阳性率为74.3%（26/35）；血清CEA高于正常对照值（5.0 ng/mL）的有21例，正常范围内的有14例，阳性率为60.0%（21/35）。健康人群中血浆Septin9甲基化阳性0例，阴性30例，阳性率为0.0%（0/30）；血清CEA高于正常对照值（5.0 ng/mL）的有3例，正常范围内的有27例，阳性率为10.0%（3/30）。Septin9甲基化和血清CEA在结直肠癌患者和健康人群中的表达差异均有统计学意义（均P＜0.001）。见表1。

表1 结直肠癌患者及健康人血浆Septin9甲基化和血清CEA的表达情况Tab.1 Comparison of plasma Septin9 methylation andserum CEA in colorectal cancerpatients and health controls

2.2 治疗前后结直肠癌患者血浆Septin9甲基化的表达35例结直肠癌患者中有26例直接接受手术治疗，另外9例接受FOLFOX方案化疗。手术组中有20例术前为Septin9甲基化阳性，6例为阴性；经手术完全切除肿瘤后由阳性变为阴性15例（转阴率为75.0%），持续阳性5例，持续阴性的6例；术前血清CEA阳性（＞5.0 ng/mL）的有15例，阴性（＜5.0 ng/mL）有11例，术后由阳性变为阴性11例（转阴率为73.3%），持续阳性4例，持续阴性的11例。

在化疗组中，化疗前血浆Septin9甲基化阳性有6例，阴性3例，经化疗后由阳性变为阴性1例（转阴率16.7%），持续阳性5例，持续阴性3例；化疗前血清CEA阳性（＞5.0 ng/mL）的有6例，阴性（＜5.0 ng/mL）有3例，化疗后由阳性变为阴性1例（转阴率为16.7%），持续阳性5例，持续阴性有3例。分析结果显示，无论对于血浆Septin9甲基化或血清CEA水平，手术治疗后指标转阴率较化学治疗更高（P=0.010，P=0.018）。见表2。

表2 手术治疗和化学治疗前后血浆Septin9甲基化血清CEA水平的变化Tab.2 Changes of plasma Septin9 methylation，serumCEA before and after operation and chemotherapy

2.3 血浆Septin9甲基化与临床病理特征的相关性通过记录每例样本的性别、年龄、肿瘤位置及TNM分期等临床资料，与血浆Septin9甲基化检测结果进行相关性分析（因35例结直肠癌患者中有2例无法确定病理分期，因此TNM分期与血浆Septin9甲基化相关性分析只纳入33例患者）。结直肠癌患者血浆Septin9甲基化与临床各病理参数的相关性如表3所示，Septin9甲基化水平与结直肠癌患者的年龄、性别、肿瘤部位、TNM分期和是否存在远处转移均无明显相关性（P＞0.05）。

2.4 血浆Septin9甲基化和血清CEA联合检测对结直肠癌诊断的意义上述部分结果表明血浆Septin9甲基化与临床结直肠癌诊断的相符率为74.3%，血清CEA对结直肠癌诊断阳性率为60.0%，两者比较差异无统计学意义（P=0.203），提示两者诊断效能相类似。为进一步分析两种分子标志物对提高结直肠癌诊断的准确性，笔者分析了血浆Septin9甲基化联合血清CEA水平对结直肠癌的诊断率，结果显示两者联合诊断结直肠癌的阳性率为82.9%，较单独检测血清CEA水平的阳性率明显升高（P=0.034）。见表4。

表3 35例结直肠癌患者血浆Septin9甲基化与临床病理参数的相关性Tab.3 Relationship between plasma Septin9 methylation and clinicopathological parametersin 35 colorectal cancer patients

表4 血浆Septin9甲基化和血清CEA水平检测对结直肠癌诊断比较Tab.4 Comparison of the diagnostic value between plasma Septin9 methylation and serum CEA

3 讨论

Septin基因广泛存在于绝大多数真核生物中，人类基因组中已发现14个Septin基因，分别被命名为Septin1～Septin14。现已发现Septin家族与神经系统疾病、肿瘤、感染、不育症等疾病发生有关。Septin基因家族相关的肿瘤疾病包括白血病及中枢神经系统肿瘤、结直肠癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、肾细胞癌等实体肿瘤。Septin9定位于染色体17q25.3，该染色体区段是散发性卵巢癌和乳腺癌的常见杂合性丢失部位。研究表明，结直肠癌的发生、发展与基因的甲基化密切相关［3]，基因芯片检测结果分析表明Septin9在乳腺、中枢神经系统、子宫内膜、肾脏、肝、肺、淋巴、食管、卵巢、胰腺、软组织、皮肤、甲状腺等来源的肿瘤中高表达。

目前有研究表明血浆Septin9甲基化在结直肠癌诊断中具有一定的意义［4-12]。学者发现直结肠癌患者患病的过程中体内的部分基因发生甲基化，将甲基化的异常基因作为分子标记物对于疾病的筛查具有一定的可操作性［13-14]。GRÜTZMANN等［15]进行了结直肠癌患者血浆甲基化Septin9检测研究，其结果显示血浆甲基化Septin9在结直肠癌患者中的阳性率为48%（120/252），明显高于健康对照组的7%（7/102）。康倩等［16]研究表明，结直肠癌患者血浆中Septin9基因甲基化检测的灵敏度为75.0%，特异度为98.1%，优于粪便隐血试验。有研究发现，Septin9基因甲基化检测结直肠癌不受年龄和性别的影响，但其基因甲基化水平与种族有一定的相关性［17-18]。本研究通过分析结直肠癌患者治疗前后血浆Septin9甲基化状态与血清CEA蛋白水平，发现血浆Septin9甲基化对结直肠癌的诊断阳性率与血清CEA水平相似，两者联合检测可显著提高诊断阳性率；治疗后血浆Septin9甲基化状态也可出现相应变化，提示其也可用于治疗期间的病情监测。

在本研究中，结直肠癌患者中Septin9的甲基化水平显著高于健康人群，其阳性率达到74.3%，再加上血浆Septin9甲基化水平检测具有无创、简便、灵敏度较高的优势，故笔者认为其是辅助结直肠癌诊断较为理想的指标。在本研究中，笔者还发现手术组结直肠癌患者中，手术切除肿瘤后血浆Septin9甲基化由阳性变化为阴性的比例显著高于化疗组，两者比较差异有统计学意义（P=0.010），提示Septin9的甲基化水平与结直肠癌患者的带瘤状态显著相关，并具有类似于血清CEA可监测结直肠癌患者治疗后复发转移的潜能，但其预测作用及其特异性仍需进一步研究。

由于本研究的结果提示血浆Septin9甲基化与血清CEA均有辅助结直肠癌诊断的作用，但单独检测血浆Septin9甲基化或血清CEA仍容易漏诊一部分结直肠癌患者；且在健康人群中，血清CEA也存在一定的假阳性率，目前关于血浆Septin9甲基化和血清CEA联合检测的报道较少，需进一步对该方向进行深入研究。为此，本研究分析了血浆Septin9甲基化与血清CEA水平联合检测对结直肠癌的诊断阳性率，其结果为82.9%，与CEA单独检测比较差异有统计学意义（P=0.034），提示血浆Septin9甲基化与血清CEA的联合检测可以提高结直肠癌检测的阳性率。同时Septin9的甲基化水平检测可提示结直肠癌患者的荷瘤状态。因此，检测Septin9的甲基化水平，特别是与CEA联合进行检测，具有重要的临床应用价值。

综上所述，血浆Septin9甲基化水平的检测具有可作为结直肠腺癌的筛查和诊断指标的潜能，其对结直肠癌的诊断效能与血清CEA相类似，阳性符合率高达74.3%，且本研究中Septin9甲基化水平诊断结直肠癌的敏感性稍优于血清CEA水平的检测。若将血浆Septin9甲基化水平检测及血清CEA水平检测二者联合应用，其敏感性优于血清CEA单独检测，两者联用可以提高结直肠腺癌诊断的阳性率，具有一定的临床应用价值。