宫颈癌中DNMT1的高表达与其不良生存结局的相关性

罗舒 陈非 郭黔 文庆莲

西南医科大学附属医院肿瘤科（四川泸州 646000）

宫颈癌是目前女性最常见的恶性肿瘤之一，近三十年，中国宫颈癌发病率提高了10%～40%［1]。据世界卫生组织（WHO）数据估算，每年全世界的新发病例有528 000例，死亡约26 000例［2]。辅助放疗（放化疗）加用铂类化疗可提高单纯放疗后晚期宫颈癌患者的生存率，但5年相对生存率仍较低［3]。由于宫颈癌影响年轻女性，尤其是在发展中国家，女性失去生命不仅影响女性，而且影响整个家庭的福祉。要改变这样的现状就需要进行新颖的及量身定制的治疗方法来改变这种疾病的预后。

人乳头瘤病毒的癌蛋白E6/E7可结合和上调DNMTs，使得基于DNA甲基化的新型治疗对于宫颈癌尤为重要。尽管宫颈癌中DNMTs高表达，且与DNMT1相关的DNA甲基化在肿瘤进展中起关键作用［4-5]，但是，目前确没有研究评估DNMTs的表达与宫颈癌生存的相关性。评估DNMT1的表达程度及其与宫颈癌生存的关联是重要的，这可能提供DNMT抑制剂治疗宫颈癌的机会。研究表明DNMT抑制剂能够通过内源性逆转录病毒和癌睾丸抗原的去甲基化来上调上皮癌细胞中的免疫信号。此外，有众多临床研究在测试结合表观遗传疗法和免疫疗法治疗某些癌症的疗效，但目前并没有针对宫颈癌的测试［6]。基于此，本研究将从表观遗传学入手，探讨宫颈癌中DNMT1的高表达与其不良的生存结局的相关性，以期为宫颈癌的治疗提供新的方法。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2012～2016年在西南医科大学附属医院肿瘤科就诊的102例患者，年龄35～72岁，平均（46.18±11.10）岁。其中鳞癌75例，癌旁组织20例作为对照，腺癌30例，癌旁组织10例作为对照，同时各选取同时期因子宫肌瘤切除子宫的正常宫颈组织20例作为对照，所有新鲜组织由手术或活检获取，所有患者术前均未接受放化疗。为了满足患者数据的机密性，研究中使用的所有标本都被剥离了标识符，整个研究中只使用了编码标识符。

1.2 试剂及方法

1.2.1 DNMT1免疫组化检测将层厚约4μm的石蜡组织切片，二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，以pH 9.0的EDTA溶液进行抗原修复，抗原恢复后，将切片冷却，在去离子水（dH2O）中漂洗，并在室温下置于3.5 mol/L HCl中15 min以打开DNA，将切片用dH2O冲洗并用3.0%H2O2处理5 min以淬灭内源性过氧化物酶活性，将切片与预免疫山羊血清（3%）在室温下孵育20 min以抑制非特异性染色，然后在室温下用DNMT1抗体（1∶100浓度）孵育1 h。用Tris缓冲盐水充分洗涤后，使用多特异性体系（Signet Laboratories，Inc.，Dedham，MA，USA）检测一抗。根据制造商的说明书（Biogenex，Inc.，San Ramon，CA，USA），使用3，3-二氨基联苯胺底物试剂盒使抗体-抗原复合物可视化，并用苏木精轻度复染色。将切片依次浸入70%，95%和100%乙醇中（每次3 min），然后使其略微干燥。最后，将载玻片浸在二甲苯中3次（每次3 min），之后用盖玻片保护。

1.2.2 免疫染色评估基于对细胞核中棕色反应产物的强度的视觉评估，以两个观察者独立地记录DNMT1在细胞核中的表达程度，0（无染色）至4+（强染色）。DNMT1的表达程度是阳性的细胞的总百分比乘以适当的强度得分。除宫颈癌外，DNMT1阳性细胞百分率取正常上皮基底，下半部和上半部分的强度评分的平均值，以获得DNMT1平均表达程度。无论宫颈癌组织或正常组织报告的DNMT1表达程度均取两个观察者的平均值。

1.3 统计学方法应用Graphpad 6.01软件中survival table对DNMT1表达与生存率的关系进行统计分析。通过Kaplan-Meier方法估计存活曲线，并使用Cox的比例风险回归模型进行多变量分析。DNMT1阳性细胞百分比及表达强度的相关性以Spearman等级采用相关分析双侧检验。

2 结果

2.1 DNMT1在正常宫颈组织和宫颈癌组织中的表达DNMT1表达于细胞质和（或）细胞核中，阳性染色为淡黄色、棕黄色或棕褐色颗粒。见图1。

图1 宫颈癌组织及正常宫颈组织免疫组化染色Fig.1 Immunohistochemical staining of cervical cancer tissues and normal cervical tissues

2.2 癌组织、癌旁组织及正常组织中DNMTI阳性细胞百分比宫颈癌组织中DNMT1阳性细胞百分率显著高于正常宫颈组织，差异具有统计学意义（P＜0.000 1），同时比较宫颈癌旁组织及正常宫颈组织中DNMT1的阳性细胞百分比，可见癌旁组织显著高于正常宫颈组织，差异具有统计学意义（P＜0.000 1）。宫颈癌组织中DNMT1细胞阳性百分比显著高于正常宫颈组织，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见图2。

图2 癌组织、癌旁组织及正常组织中DNMTI阳性细胞百分比Fig.2 The percentage of DNMTI-positive cells in cancerous，paracancerous and normal tissues

2.3 宫颈腺鳞癌及正常宫颈组织中DNMT1阳性细胞百分比宫颈鳞状细胞癌中DNMT1阳性细胞百分比显著高于癌旁组织及正常宫颈组织，差异具有统计学意义（均P＜0.05）。宫颈腺细胞癌中DNMT1阳性细胞百分比显著高于正常宫颈组织，差异具有统计学意义（P＜0.000 1），而与癌旁组织间无明显差异无统计学意义（P＞0.05）。见图3。

图3 宫颈腺鳞癌及正常宫颈组织中DNMT1阳性细胞百分比Fig.3 The percentage of DNMT1 positive cells in cervical adenosquamous carcinoma and normal cervical tissue

2.4 宫颈腺鳞癌及正常组织中DNMT1强度得分宫颈腺细胞癌AC中DNMT1强度得分显著高于正常宫颈组织，差异具有统计学意义（P＜0.001），而与癌旁组织间差异无统计学意义（P＞0.05），宫颈鳞状细胞癌SCC中DNMT1强度得分显著高于癌旁组织及正常宫颈组织，差异具有统计学意义（P＜0.05，P＜0.001）。见图4。

图4 宫颈腺鳞癌及正常宫颈组织中DNMT1强度得分Fig.4 DNMT1 intensity score in cervical adenosquamous carcinoma and normal cervical tissue

2.5 DNMT1不同表达程度生存曲线选取阳性细胞百分比77.5%及评分1.394 6作为标准进行比较，消除人数所占比带来的影响。如图5该标志物表达水平低的女性相比，DNMT1阳性细胞百分比高于77.5%，DNMT1评分高于1.394 6的死亡率高4.174倍（P=0.041 1）。

图5 DNMT1不同表达程度生存曲线Fig.5 DNMT1 survival curves of different degrees of expression

3 讨论

在低收入甚至高收入国家均没有发现宫颈癌有明显的下降趋势［7]。在全球，宫颈鳞癌是主要的组织学类型，约占宫颈癌的四分之三［8-9]。HPV感染被认定为是宫颈癌的主要致病因子，但鳞癌（87%）比腺癌（62%）的阳性率更高［10]。基于HRHPV阳性率的差异，与宫颈鳞癌相比，腺癌E6/E7的表达程度可能较低。因此与鳞癌相比，腺癌结合和上调DNMT1以及DNMT1的表达也可能更低。与正常宫颈组织相比，癌组织中DNMT1的较高表达也可以通过这种现象来解释，与正常组织相比，癌组织更可能有表达E6/E7的HPV感染。

作为一种常见的表观遗传修饰形式，DNA甲基化在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生中发挥着重要作用。尽管癌细胞甲基化机制缺陷的确切性质尚不清楚，但认为与DNMTs的表达有关，在哺乳动物中DNMTs主要为DNMT1、DNMT3A、DNMT3B［11]。已经证明DNMT1可以高度亲和地识别和结合DNA损伤，例如碱基错配，尿嘧啶和其他不寻常的DNA构象，这些病变被认为存在于人类癌性病变中［12-13]。这也可以用来解释与正常宫颈相比宫颈癌组织中DNMT1的表达更高。

基于使用表观遗传改变作为治疗药物的表观遗传学治疗越来越被认为是用于癌症治疗的主流方法。DNA甲基化是一个基因可以脱甲基化的可逆过程，可恢复到原来的状态，由于DNA甲基化的这种可逆性，已经研究了DNMTis作为抗癌剂，因为它们能够恢复已表达的基因DNMT的活性［14-15]。食品和药物管理局（FDA）批准的DNMTis包括分别在2004年和2006年开发的阿扎胞苷和地西他滨，已被用于治疗骨髓增生异常综合征［17]。多个研究已经鉴定了在宫颈癌细胞中DNA甲基化在表观遗传学上失调的几种机制的差异。然而目前还没有研究评估DNMT1在宫颈癌中的表达，导致基于DNMTs治疗宫颈癌的表观遗传疗法尚处于起步阶段。一些研究评估了DNMTs在癌组织中的表达，特别是DNMT1，并且报道了肺癌［18]，胰腺癌［19]中的表达水平或其与总体生存期较短的关联。在本研究中，笔者证明在宫颈癌细胞中DNMT1的表达显著高于正常或非癌细胞，表明DNMTis可能是宫颈癌的有效和靶向治疗。笔者观察到DNMT1的高表达与不良存活率结果显着相关，这进一步确保单独使用DNMTis或联合免疫治疗将是一种改善诊断为宫颈癌的女性的存活的新方法。

尽管HPV的致癌基因有上调DNMT1的能力，如结肠直肠癌中的腺瘤性息肉病基因（APC）中DNMT1受高危HPV的独立途径调节［20]，但依旧可能有其他机制存在。这种途径是否在宫颈癌中起作用是未知的，但是HPV癌蛋白对DNMT1的上调作用表明DNMT1应该被作为宫颈癌治疗的靶目标。笔者观察到DNMT1在宫颈鳞癌中的表达高于宫颈腺癌，并且表达越高患者的预后越差。本研究的优点在于笔者详细的分析了正常宫颈组织、癌组织及癌旁组织中DNMT1的表达及相关协变量调整后的生存结果。由于缺乏信息，比如患者的体重，是否有其他疾病，治疗的周期及剂量，本研究存在一定的不足。另外只研究了DNMT1而不是所有DNMTs使本研究具有一定的局限性，下一步笔者将继续研究DNMT1外的DNMTs与宫颈癌的相关性，以期更深入的了解宫颈癌的预后与DNMTs的关系。

综上所述：宫颈癌组织中DNMT1阳性细胞率及强度得分均显著高于正常组织及癌旁组织。随着癌组织中DNMT1阳性细胞百分率的提高及强度的分的增高，宫颈癌的结局变的更差。