清窍胶囊治疗分泌性中耳炎的临床疗效以及相关机制

钟伦坤 周兴玮 何娴 朱佳丽 黄秀丽 何腾 孙永东

西南医科大学附属中医医院（四川泸州646000）

分泌性中耳炎（secretory otitis media，SOM），中医上称作耳胀、耳闭，是一种由多种病因导致的中耳非化脓性疾病，主要临床特征为中耳积液、听力下降，并可引发多种严重的并发症，包括中耳粘连、听骨坏死等。国内外研究［1]发现，2～7岁发病率最高，约为7.3%～30.7%，2岁左右为高峰，且随年龄增长而下降。该病治疗方法众多，临床效果和优缺点各不相同，但目前尚无统一规范的治疗药物。局部切开置管等手术方法有创和治疗费用高［2-3]，而且可能引发严重的并发症。目前中医界正在寻找疗效确切并且对全身及局部均有效的中成药来治疗分泌性中耳炎。

清窍胶囊是我院科室独创治疗分泌性中耳炎的经验协定方药，经20多年的临床观察，效果肯定，成为院内制剂医保甲类，经10多年的潜心研究，发现其能调节机体自身，改善机体免疫功能和中耳粘膜的排泄清理功能，并且可提高听力作用（改善耳蜗微循环），对多种病因的分泌性中耳炎疗效确切。本研究旨在通过对清窍胶囊治疗分泌性中耳炎的疗效以及动物抗炎症试验进行更深入的研究，进一步评价清窍胶囊治疗分泌性中耳炎的有效性，并了解其抗炎的分子机制，为“清窍胶囊”的新药开发研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 一般资料前瞻性纳入我院2014年12月至2015年11月收治的80例分泌性中耳炎患者为研究对象，随机分为对照组和治疗组，每组40例，对照组中男23例，女17例，年龄范围4～65岁，平均（29.6±5.6）岁；治疗组中男21例，女19例，年龄范围5～67岁，平均年龄为（30.0±5.9）岁，两组患者在年龄、性别、基础疾病等的分布上差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

1.2 诊断标准（1）耳痛、耳闷、耳鸣和听力下降；（2）鼓膜内陷、活动受限和积液征；（3）纯音测听：传导性聋；（4）声导抗：鼓室压图有平坦型（B型）的典型特征；高负压型（C型）示咽鼓管功能不良，部分有鼓室积液、镫骨肌反射消失；（5）鼓膜穿刺抽出积液（对于C型中不能抽出鼓室积液的不纳入本研究中）。

1.3 纳入与排除标准纳入标准：（1）符合以上诊断标准；（2）年龄2～70岁；（3）无严重并发症如鼓室严重粘连及硬化；（4）无其他严重的全身疾病者；（5）急性分泌性中耳炎（病程3个月内）；（6）签署研究知情同意书者。排除标准：（1）妊娠期及哺乳期妇女、精神疾病病人；（2）＜2岁或＞70岁患者；（3）有头孢类药物过敏史者；（4）因腭扁桃体肥大、腺样体肥大、腭裂、鼻窦炎、鼻咽纤维血管瘤及鼻咽癌等原因引起的分泌性中耳炎；（5）慢性分泌性中耳炎。剔除标准：（1）无完整病历资料且无法判断疗效；（2）中途退出观察，不能判断疗效者；（3）研究病例结束后无法随者。

1.4 分组方法组1：头孢克洛胶囊（昆明积大制药有限公司，批号040103），成人0.5 g/d，每日3次，儿童20 mg/（kg·d），一个疗程为10 d。组2：清窍胶囊，成人1.6 g/次，每日3次，儿童按照120 mg/（kg·d）温热水吞服，每日3次。共2个疗程，1个疗程为期10 d。共观察1～2个疗程，观察期间，两组均不得使用其它任何药物（“列入标准”允许的药除外）。

表1 两组一般资料比较Tab.1 Characteristics of the patients in the two groups

1.5 实验动物60只昆明大鼠购自泸州医学院动物实验中心，SPF级，重量18～25 g，耳廓反射灵敏。将其随机分成3组，分别为对照组、安慰剂组和治疗组，每组20只，所有小鼠都通过了耳窥镜的检查，结果表明所有小鼠均无外耳道和中耳感染。

1.6 建模方法将1.2 mg卵清蛋白溶于0.6 mL PBS缓冲液配置成溶液，同时使用5.14 mg的氢氧化铝作为免疫佐剂，腹腔注射对照组和清窍胶囊治疗组的小鼠，每周1次共2周，此过程为全身致敏阶段，2周后，用20%乌拉坦以5 mL/kg的剂量腹腔内注射麻醉小鼠，将15μL配置的OVA/PBS混合液经鼓膜前下方注入鼓室，24 h后再次麻醉小鼠，观察鼓膜状态，注射第2次，此为耳内激发阶段，建立分泌性中耳炎小鼠模型，造模成功标志参照Pollock HW等的小鼠造模实验［5]。

1.7 实验材料、试剂和仪器卵清蛋白（Ovalbumin）为美国Sigma公司生产，小鼠、人HIF-1a、VEGF的ELISA试剂盒均为默克公司产品。清窍胶囊为医院内制剂，批准文号：川药制字Z20080310。配方如下：玄参9 g、生地9 g、丹参12 g、川牛膝6 g、僵蚕4 g、当归9 g、薏苡仁18 g、豆蔻6 g、甘草9 g。酶标仪为美国Promega公司生产。

1.8 疗效评价比较两组电测听、声阻抗和不良反应发生率。其中电测听［6]分别在 500、1 000、2 000 Hz频率下取平均听阀，听力≤26 dB为正常；＞26 dB轻度耳聋；＞41 dB中度耳聋；＞56 dB重度耳聋；＞71 dB是听力几乎损失。运用GSl2000 TympstarII型中耳分析仪，226 Hz探测音，分别测试双耳的外耳道容积、声顺值、峰压值，并绘制鼓室导抗图［7]。不良反应［8]：主要为心慌、过敏、白细胞减少、恶心呕吐等。分别于治疗前后用ELISA法检测两组患者中耳积液中HIF-1a、VEGF的水平变化。

1.9 分泌性中耳炎模型小鼠中耳积液中HIF-1a、VEGF的表达水平将60只小鼠按照1.5中的方法造模成功后，随机分为3组，每组20只，分别为安慰剂组、对照组对和治疗组，采用ELISA法检测3组小鼠中耳积液中HIF-1a、VEGF的浓度。

1.10 清窍胶囊对小鼠HIF-VEGF通路信号分子的影响将清窍胶囊内容物配成浓度为0.4 g/mL的溶液，按0.2 mL/10 g体质量灌胃，上、下午各1次。7天为1个疗程，连续使用2个疗程，对照组按头孢克洛胶囊内容物配成浓度为0.4 g/mL的溶液，按照0.2 mL/10 g体质量灌胃，安慰剂组同法给予等体积生理盐水灌胃。ELISA法检测3组小鼠中耳积液中HIF-1a、VEGF的浓度。

1.11 统计学方法采用SPSS 19.0软件分析，计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，计数资料采用百分比表示，运用χ2检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2结 果

2.1 清窍胶囊对分泌性中耳炎的临床疗效观察

2.1.1 两组电测听和声阻抗测试治疗前两组电测听差异无统计学意义（P＞0.05）；经治疗后，组2电测听高于组1（P＜0.05），差异具有统计学意义，见表2。组1和组2各80耳中，B型分别为59耳、57耳，C型分别为为21耳、23耳（负压水平超过一200 daPa），治疗前差异无统计学意义（P＞0.05）；治疗后，组1的80耳中，14耳为As型，5耳为A型，47耳为B型，14耳为C型，组2的80耳中，32耳为As型，4耳为A型，27耳为B型，7耳为C型，两组耳型分布差异有统计学意义（P＜0.05），见表3。

2.1.2 两组不良反应发生率比较组2和组1总的不良反应发生率分别为7.50%和20.00%，组2明显低于组1，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表4。

2.2 建模前后3组小鼠中耳积液中HIF-1a、VEGF的表达水平的比较与建模前相比，3组在建模后中耳积液中HIF-1a、VEGF的表达水平显著升高（P＜0.01），差异具有统计学意义（表5），且3组治疗前中耳积液中HIF-1a、VEGF差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2 两组电测听的对比Tab.2 Comparison of electro-audiometer in the two groups before and after the treament

表4 两组不良反应发生率比较Tab.4 Comparison of adverse effect in the two groups after the treament 例（%）

表5 分泌性中耳炎模型小鼠中耳积液中HIF-1a、VEGF的改变Tab.5 Comparison of level of HIF-1a and VEGFin the three groups before and after the modeling ±s

表5 分泌性中耳炎模型小鼠中耳积液中HIF-1a、VEGF的改变Tab.5 Comparison of level of HIF-1a and VEGFin the three groups before and after the modeling ±s

注：a与造模前相比，P＜0.05

分组安慰剂组对照组治疗组例数20 20 20 HIF-1a（ng/mL）造模前0.51±0.11 0.50±0.12 0.52±0.13造模后6.71±1.11a 6.86±1.30a 6.76±1.18a VEFG（ng/mL）造模前0.42±0.19 0.43±0.18 0.41±0.20造模后5.82±1.19a 5.68±1.12a 5.95±1.48a

2.3 治疗前后3组小鼠中耳积液中HIF-1a、VEGF水平比较如表6所示，3组治疗前中耳积液中HIF-1a、VEGF浓度差异无统计学意义，治疗后均显著下降（P＜0.05），且安慰剂组、对照组和治疗组上述两种因子浓度依次降低，且差异具有统计学意义（P＜0.05）。

表6 治疗前后3组小鼠中耳积液中HIF-1a、VEGF水平比较Tab.6 Comparison of level of HIF-1a and VEGF in the three groups before and after the treament ±s

表6 治疗前后3组小鼠中耳积液中HIF-1a、VEGF水平比较Tab.6 Comparison of level of HIF-1a and VEGF in the three groups before and after the treament ±s

注：a与治疗前比较，P ＜ 0.05；b与安慰剂组比较，P ＜ 0.05；c与对照组比较，P＜0.05

分组安慰剂组对照组治疗组F值P值例数20 20 20 HIF-1a（ng/mL）治疗前5.78±1.20 5.86±1.30 5.76±1.18 88.26 0.0014治疗后4.68±0.28a 3.16±0.25ab 1.26±0.23abc 41.21 0.017 VEGF（ng/mL）治疗前5.44±1.22 5.42±1.21 5.53±1.28 65.17 0.0006治疗后4.32±0.24a 3.21±0.26ab 1.67±0.18abc#28.16 0.019

2.4 清窍胶囊对分泌性患者中耳积液中HIFVEGF通路信号分子的影响如表7所示，治疗后，2组中耳积液HIF-1a、VEGF浓度均显著低于治疗前，且组2中耳积液中HIF-1a、VEGF的浓度明显低于组1（P＜0.05），差异具有统计学意义。

表7 两组治疗前后中耳积液中HIF-1a、VEGF分泌量比较Tab.7 Comparison of level of HIF-1a and VEGF in the two groups before and after the treament ±s

表7 两组治疗前后中耳积液中HIF-1a、VEGF分泌量比较Tab.7 Comparison of level of HIF-1a and VEGF in the two groups before and after the treament ±s

注：a与治疗前比较，P ＜ 0.05；b与组2比较，P ＜ 0.05

分组组1组2 t值P值例数40 40 HIF-1a(ng/mL)治疗前6.63±1.17 6.75±1.38 0.68 0.092治疗后3.47±1.04ab 2.28±1.12a 8.16 0.025＊VEGF(ng/mL)治疗前6.15±1.27 6.21±1.43 0.27 0.121治疗后4.26±1.38ab 2.56±1.03a 10.26 0.021＊

3 讨论

分泌性中耳炎（secretory otitis media，SOM）是临床上的常见感染性耳部疾病，西医上总结其病因包括咽鼓管功能障碍、感染、免疫反应等方面。分泌性中耳炎可诱发多种后遗症，如中耳粘连、鼓膜萎缩硬化、等，影响患者的身心健康。临床上有多种治疗手段，如内科治疗包含全身药物治疗（中药、抗生素，抗过敏药物）、局部药物治疗；外科治疗有鼓膜穿刺抽液、鼓膜切开术等多种手术方法。各种方式针对性强，各有优缺点，有一定疗效，但多不理想。目前的各种手术方法因其具有损伤性及痛苦性，无法作为分泌性中耳炎的首选治疗方法［2，10]。中医观点以为正气不足，内蕴湿热，外受风邪，致热毒堕盛，循肝胆经上冲于耳窍是引起耳张、耳闭的主要原因。

近年来研究发现，IL家族（如IL-1B、IL-2、IL-4等）以及TNF-α、VEGF和HIF-1a等与中耳炎密切相关［11]。同时，较多的学者认为HIF-VEGF信号通路可能为中耳炎发病的重要机制，如SEMENZA等［11]发现在分泌性中耳炎大鼠模型中耳黏膜HIF-1a、VEGF的基因和蛋白的表达水平明显升高；重组VEGF蛋白注入鼠的中耳腔用来建立分泌性中耳炎动物模型［12]，HIF-VEGF信号通路在血管增生、通透性增加的过程中扮演重要角色，同时文献证据显示其在SOM中耳积液产生方面可能也具有重要作用［13]。但国内鲜有相关报道鲜有。本研究通过建立分泌性中耳炎小鼠模型，发现HIF-VEGF在分泌性中耳炎小鼠模型中的表达明显升高，与文献中相符，促使我们更深入的了解分泌性中耳炎模病理及生理机制。

进一步探讨清窍胶囊对急性分泌性中耳炎患者的影响，结果表明，清窍胶囊在动物水平和人体水平上均可抑制HIF-VEGF信号通路，治疗后HIF-1a、VEGF浓度均显著下降。此外，与常规治疗药物头孢克洛相比，清窍胶囊的临床疗效更优，患者听力显著提升，同时不良反应发生率显著较低。这可能主要是因为：清窍胶囊是根据多年的临床经验配制而成，可做到标本兼治，延缓中耳分泌液的产生，促进吸收，促使阻塞的咽鼓管逐渐通畅。其发挥药理作用的特点包括［14]：（1）可明显提高机体的免疫功能，并促进中耳黏膜排泄和清理；（2）通过改善耳蜗微循环以提高听力。

虽然本研究结果显示，经过治疗后各组HIF-1a、VEGF浓度未恢复到治疗或造模前水平，但已经非常接近。另外，由于本研究周期只有2个疗程，相对较短，考虑到中药起效时间比较缓慢，所以需要今后进行进一步开展多中心大样本研究，并延长观察期限进行进一步探讨。另外，清窍胶囊在治疗分泌性中耳炎的药理机制可能还涉及其他信号通路，也是未来研究和探讨的方向。

综上所述，清窍胶囊可能通过影响HIF-VEGF信号通路来发挥治疗急性分泌性中耳炎的作用，且临床疗效优于头孢克洛胶囊，值得进一步临床推广。