奶粉中维生素D3含量的测定

文/房启波 于春艳

（黑龙江摇篮乳业股份有限公司）

维生素D是一种脂溶性维生素，是人类生长发育过程中不可缺少的重要物质。研究发现婴幼儿、孕妇、中老年等人群均是维生素D不足的高危人群。维生素D缺乏不仅导致钙的吸收利用降低，出现佝偻病、骨软化症、骨量减少及骨质疏松，而且可能导致免疫系统功能紊乱。

婴幼儿配方奶粉和功能奶粉中均对维生素D（一般添加维生素D3）进行了强化，可以满足婴幼儿、孕妇、中老年等人群维生素D补充的需要。准确测定奶粉中维生素D的含量具有十分重要的意义。本文采用高效液相色谱法，使用外标法定量对奶粉中的维生素D3含量进行测定。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

1.1.1 仪器

分析天平（感量为0.1 mg）；旋转蒸发仪；磁力搅拌器；氮吹仪；紫外分光光度计（UV1800）；萃取净化振荡器；高效液相色谱仪（带紫外检测器，LC20A）。

1.1.2 试剂

无水乙醇（色谱纯）；抗坏血酸；氢氧化钾；正己烷；二丁基羟基甲苯（B u t y l a t e d Hydroxytoluene，BHT）；石油醚（沸程30～60 ℃）；无水硫酸钠；甲醇（色谱纯）。

维生素D3标准品，纯度＞98%，配制成浓度约为100μg/mL的标准储备液，使用前用紫外分光光度计对浓度进行校正，标准中间液和使用液的准确浓度需按照校正后的浓度折算。

维生素D3标准溶液浓度校正方法：取维生素D3标准储备液100μL于10 mL棕色容量瓶中，用无水乙醇定容至刻度，混匀，倒入1 cm石英比色杯中，以无水乙醇为空白参比，在264 nm波长下测定其吸光度（A）。浓度（C）计算公式：C=A×104/E，其中维生素D3的E值为462。

1.2 样品处理

称取5 g样品于150 mL三角瓶中，加入20 mL温水溶解，加入1.0 g抗坏血酸和0.1 gBHT，混匀。然后加入30 mL无水乙醇，再加入10 mL氢氧化钾溶液，边加边振摇，混匀后放置在恒温磁力搅拌器上，80 ℃回流皂化30 min，皂化后立即用冷水冷却至室温。

将皂化液转移至250 mL分液漏斗中，加入50 mL石油醚振荡萃取5 min，萃取过程注意排气。然后将水相转移至另一分液漏斗中，再加50 mL石油醚进行二次萃取，合并石油醚液。随后用约100 mL水洗涤石油醚层，重复3 次至溶液近中性。

石油醚层经无水硫酸钠过滤入250 mL旋转蒸发瓶中，过滤后用约15 mL石油醚冲洗分液漏斗及无水硫酸钠2～3 次，并入蒸发瓶中，40 ℃浓缩至近干，氮气吹干，用正己烷定容至2 mL，涡旋振荡，充分混匀，经0.22 μm有机滤膜过滤，待净化。

1.3 净化

由于维生素D的异构形式较多，不易与其它化合物分离，较难测定，为了排除干扰，样品测定前需通过正相色谱净化富集。

取1 mL维生素D3标准中间使用液，氮气吹干，用10 mL正己烷溶解。取该溶液100μL注入液相色谱仪中进行测定，测得保留时间为11.50 min。将500 μL待测液注入液相色谱仪中，在10.8～13.8 min收集馏分，氮气吹干后准确加入1 mL甲醇，振荡溶解，用于定量分析。

样品净化时，加入0.8%异丙醇可以调节维生素D3的保留时间，使之与干扰物分离。

1.4 净化色谱条件

色谱柱为硅胶柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流动相为环己烷+正己烷（1+1，体积），并加入0.8%（体积分数）异丙醇；流速1 mL/min；波长为264 nm；柱温（35±1） ℃；进样体积500μL。

1.5 样品定量分析色谱条件

色谱柱为C18柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流动相为甲醇+水（95+5，体积）；流速1 mL/min；检测波长264 nm；柱温（35±1） ℃；进样体积100μL。

2 结果

2.1 方法线性范围

将浓度为0.02、0.04、0.08、0.16、0.20μg/mL的维生素D3标准系列工作液注入液相色谱仪中，标准溶液液相色谱图见图1。测得标准系列工作液的峰面积分别为5 921、12 125、24 294、48 652、61 703 mAU*min。以峰面积为纵坐标，工作液浓度为横坐标，绘制标准曲线。结果表明，维生素D3在0.02～0.20μg/mL范围内线性关系良好，线性回归方程为y＝308 429x－303.32，相关系数为0.9999。

2.2 添加回收率测定

采用外标法定量时需要验证回收率能否满足检测要求。在已知维生素D3含量的样品中分别加入维生素D3标准品0.4μg、0.8μg、1μg，每个添加水平做6 次平行试验，经与样品相同步骤处理后测定维生素D3含量，计算添加回收率。3 个添加水平（0.4μg、0.8μg、1μg）的平均回收率（n=6）分别为85.26%、87.78%、90.01%，相对标准偏差（RSD）（n=6）分别是0.88%、1.01%、0.76%，表明本方法处理和净化过程中维生素D3的损失少。

2.3 检出限和定量限

当称样量为2 g时，以3 倍信噪比（S/N）计算，维生素D3的检出限为0.2μg/100 g，定量限为0.6 μg/100 g。

3 讨论

图1 维生素D3标准品液相色谱图

3.1 由于维生素D遇光照容易发生损失，样品应避光冷藏，尽快测定。样品处理过程应避免紫外光照，尽可能避光操作。测定过程使用的所有器皿不得含有氧化性物质，分液漏斗活塞玻璃表面不得涂油。

3.2 维生素D皂化过程对测定结果影响很大，要控制好皂化温度和时间，一般皂化时间为30 min；如果皂化液冷却后液面有浮油，需要加入适量氢氧化钾溶液，并适当延长皂化时间。

3.3 本方法回收率和重现性好，适合奶粉中维生素D3含量的测定。