miR-181a-5p靶向Kras对乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖及凋亡的调控作用

何建苗，赵华洲，王婷，邱啸臣，翁剑峰，张心慧，曹志宇

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，其发病率近年来逐渐上升，严重威胁女性的生命健康[1]。调查显示，世界范围内每年新增120万乳腺癌病例，且约有50万患者死于本病[2]。虽然以手术、放疗、化疗等为主的综合治疗方案可有效改善乳腺癌患者的生活质量，提高5年生存率，但仍不尽如人意[3]。因此，寻求更加安全、高效的乳腺癌治疗方法是临床亟待解决的重点及难点问题。微RNA(microRNA，miRNA)是一类内源性非编码小分子RNA，参与了人类基因组中30%左右基因的表达调控，在细胞增殖、凋亡、分化等过程中发挥至关重要的作用[4]。近半数的miRNA位于与恶性肿瘤相关的基因区域和(或)脆性位点，故其在恶性肿瘤的发生发展过程中起着类似抑癌或致癌基因的作用[5]。miR-181a-5p是人类pre-miR-181a产生的剪接体之一。Li等[6]发现，miR-181a-5p在乳腺癌组织中呈低表达状态，提示其可能参与了乳腺癌的进展过程。但miR-181a-5p对其下游靶基因的调控作用及其机制尚未完全明确。Kras属于Ras基因家族，在所有Ras基因中，Kras与人类恶性肿瘤的关系最为密切，可发挥类似分子开关的作用，通过传递细胞信号引发恶性肿瘤细胞的一系列反馈，包括增殖、分化、侵袭及迁移等[7-8]。miR-181a-5p靶控Kras对细胞增殖、凋亡的调控作用已在非小细胞肺癌中得到证实[9]，但其是否可通过靶向Kras调控乳腺癌细胞的增殖及凋亡尚不明确。本研究检测了乳腺癌细胞系MDAMB-231中miR-181a-5p和Kras的表达变化，并观察了miR-181a-5p靶向Kras对MDA-MB-231细胞增殖、凋亡的调控作用，旨在为乳腺癌细胞的分子靶向治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 乳腺癌细胞系MDA-MB-231、人乳腺细胞系HBL-100(美国ATCC细胞库)；RNA提取试剂盒、PCR试剂盒、质粒提取试剂盒、LipofectamineTM2000转染试剂盒、反转录试剂盒、miR-181a-5p mimics、阴性对照mimics、Kras 3'-非翻译区(untranslated region，UTR)质粒(美国Invitrogen公司)；细胞凋亡检测试剂盒、细胞周期检测试剂盒(美国BD公司)；MTT(美国Sigma公司)；双荧光素酶报告基因检测试剂盒(Dual luciferase assays，美国Promega公司)；Kras单克隆抗体(美国Abcam公司)；ECL化学发光试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物试剂有限公司)。miR-181a-5p引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 常规复苏乳腺癌细胞系MDAMB-231、人乳腺细胞系HBL-100，分别用DMEM培养液(10%胎牛血清+1%双抗)重悬细胞，并置于恒温培养箱(37℃、5%CO2)中培养，每天换液1次，收集对数生长期细胞进行后续实验。

1.2.2 细胞转染及分组 收集上述对数生长期的MDA-MB-231细胞，采用DMEM培养液(10%胎牛血清+1%双抗)调整细胞浓度至2×105个/ml，然后接种于6孔板中，每孔1ml，共12孔。利用LipofectamineTM2000分别将300nmol/L miR-181a-5p mimics(miR-181a-5p组)、阴性对照mimics(阴性对照组)转染至细胞中，空白对照组仅加入等量PBS，每组设3个复孔，细胞置于恒温培养箱(37℃、5%CO2)培养24h。待转染结束后，常规收集细胞待进行后续实验。

1.2.3 RT-PCR法检测MDA-MB-231及HBL-100细胞中miR-181a-5p的表达 收集各组细胞，采用RT-PCR法检测miR-181a-5p的表达。参照Trizol试剂盒说明书提取细胞总RNA，反转录至cDNA，取反转录产物以SYBR Green法行RTPCR，以U6为内参照。PCR反应条件：94℃预变性4min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸40s，共40个循环。引物序列如下：miR-181a-5p正义5'-CAAATTATTGTGGGTTGTC-3'，反义5'-TTATGGGTAGATGGGTGA-3'；U6正义5'-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3'，反义5'-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3'。

1.2.4 Western blotting检测MDA-MB-231及HBL-100细胞中Kras蛋白的表达 采集各组细胞，常规提取蛋白，BCA法定量，取适量行SDS-PAGE凝胶电泳，转至硝酸纤维膜，5%封闭液4℃封闭4h，依次加入一抗(1:2000)、二抗(1:500)孵育，按ECL试剂盒说明书进行电化学发光检测。

1.2.5 MTT法检测细胞增殖活性 收集各组细胞，于转染结束后置于恒温培养箱(37℃、5%CO2)中继续培养4h，300×g离心5min后弃上清，每孔加入5mg/ml MTT溶液20μl，继续置于恒温培养箱(37℃、5%CO2)中培养24h，300×g离心5min后弃上清，每孔加入100μl DMSO，振荡10min，使结晶物充分溶解，采用全自动酶标仪测定450nm处吸光度(OD)值。

1.2.6 流式细胞仪检测细胞凋亡情况 收集各组细胞，转染结束后将细胞置于恒温培养箱(37℃、5%CO2)中继续培养48h，采用凋亡试剂盒(Annexin-V/PI)检测细胞凋亡情况。调整细胞浓度为5×105个/ml，取195μl上述细胞悬液加入5μl Annexin-V-FITC，室温孵育3min，然后加入10μl PI，室温避光孵育10min，加入300μl缓冲液，混匀，上流式细胞仪检测细胞凋亡情况。细胞凋亡率(%)=(右上象限细胞+右下象限细胞)/总细胞数×100%。

1.2.7 流式细胞仪检测细胞周期 收集各组细胞，转染结束后将细胞置于恒温培养箱(37℃、5%CO2)中继续培养48h，调整细胞浓度至5×105个/ml，用0.01mol/L PBS洗涤1次，300×g离心5min后弃上清，加入500μl 70%冷乙醇(-20℃)后置于-4℃冰箱过夜培养，0.01mol/L PBS洗涤细胞3次，加入100μl RNase A，37℃水浴30min，加入400μl PI，吹打均匀，4℃避光孵育30min。上流式细胞仪检测细胞周期。

1.2.8 双荧光素酶报告基因实验 收集对数生长期的MDA-MB-231细胞，用DMEM培养液(10%胎牛血清+1%双抗)调节细胞密度至2×105个/ml，将野生型Kras 3'-UTR(Kras-wt)质粒、突变型Kras 3'-UTR(Kras-Mut)与miR-181a-5p mimics或阴性对照mimics共转染至MDA-MB-231，每组设3个复孔，置于恒温培养箱(37℃、5%CO2)中继续培养48h，然后以海肾质粒荧光值作为内参，检测各组细胞的荧光素酶活性。

1.3 统计学处理 采用SPSS 20.0软件进行统计分析。计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 MDA-MB-231及HBL-100细胞中miR-181a-5p和Kras蛋白的表达 RT-PCR检测结果显示，MDAMB-231细胞中miR-181a-5p的表达明显低于HBL-100细胞(P＜0.05)。Western blotting检测结果显示，MDA-MB-231细胞中Kras的蛋白表达明显高于HBL-100细胞(P＜0.05，图1)。

2.2 转染miR-181a-5p mimics对MDA-MB-231细胞中miR-181a-5p及Kras蛋白表达的影响 RT-PCR检测结果显示，与转染阴性对照mimics相比，转染miR-181a-5p mimics后MDA-MB-231细胞中miR-181a-5p表达明显上调(P＜0.05)。Western blotting检测结果显示，与转染阴性对照mimics相比，转染miR-181a-5p mimics后MDA-MB-231细胞中Kras蛋白表达明显下调(P＜0.05，图2)。

2.3 转染miR-181a-5p mimics对MDA-MB-231细胞增殖活性的影响 MTT法检测结果显示，转染miR-181a-5p mimics后MDA-MB-231细胞增殖活性(0.49±0.26)明显低于转染阴性对照mimics组(1.51±0.11)及空白对照组(1.40±0.23)，差异有统计学意义(P＜0.05)。

图1 MDA-MB-231及HBL-100细胞中miR-181a-5p和Kras蛋白的表达Fig. 1 Expressions of miR-181a-5p and Kras proteins in MDA-MB-231 and HBL-100 cells

图2 转染miR-181a-5p mimics对MDA-MB-231细胞中miR-181a-5p和Kras蛋白表达的影响Fig. 2 Effects of miR-181a-5p mimics transfection on the expressions of miR-181a-5p and Kras in MDA-MB-231 cells

2.4 转染miR-181a-5p mimics对MDA-MB-231细胞凋亡的影响 流式细胞仪检测结果显示，转染miR-181a-5p mimics后MDA-MB-231细胞凋亡率(35.6%±4.4%)明显高于转染阴性对照mimics组(13.4%±3.0%)及空白对照组(12.5%±2.1%)，差异有统计学意义(P＜0.05，图3)。

2.5 转染miR-181a-5p mimics对MDA-MB-231细胞周期的影响 流式细胞仪检测结果显示，转染miR-181a-5p mimics后MDA-MB-231细胞G2/M期细胞比例(19.8%±3.4%)明显增高，S期细胞比例(46.8%±3.3%)明显降低，与转染阴性对照mimics组(分别为13.4%±3.7%、55.9%±4.2%)及空白对照组(分别为13.8%±3.5%、57.3%±5.1%)比较差异有统计学意义(P＜0.05，图4)。

图3 转染miR-181a-5p mimics对MDA-MB-231细胞凋亡的影响Fig. 3 Effects of miR-181a-5p mimics transfection on the apoptosis of MDA-MB-231 cells

图4 转染miR-181a-5p mimics对MDA-MB-231细胞周期的影响Fig. 4 Effects of miR-181a-5p mimics transfection on the MDA-MB-231 cell cycle X axis shows DNA contents, Y axis shows cell number per unit volume

2.6 双荧光素酶报告基因检测结果 双荧光素酶报告基因检测结果显示，共转染miR-181a-5p mimics与Kras 3'-UTR野生质粒后，MDA-MB-231细胞荧光素酶活性较转染阴性对照mimics组明显降低(P＜0.05)；共转染miR-181a-5p mimics与Kras 3'-UTR突变质粒后，MDA-MB-231细胞荧光素酶活性无明显改变(P＞0.05，图5)。

图5 MDA-MB-231细胞荧光酶素活性的变化Fig. 5 Changes of the activity of MDA-MB-231 cell fluorescent enzyme

3 讨 论

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，全球发病率和病死率均呈逐年上升趋势。研究乳腺癌发生、发展、浸润、转移的相关因素，对降低乳腺癌的发病率、提高患者生存率具有重要意义。乳腺癌的发生、发展与机体多基因、多步骤的调节有关，因此，研究乳腺癌的癌基因和抑癌基因的相关信号通路及其影响因素是近年的热点之一。

miR-181a-5p已被证实与多种恶性肿瘤的发生与发展密切相关，但其在不同恶性肿瘤中的作用及机制不尽相同。Korhan等[10]研究证实，miR-181a-5p在肝细胞癌组织中表达降低或缺失，而过表达miR-181a-5p可抑制酪氨酸蛋白激酶受体c-Met活性，进而抑制肝癌细胞增殖，提示miR-181a-5p在肝细胞癌中起着类似抑癌基因的作用。Chen等[11]研究发现miR-181a-5p在胃癌组织中呈高表达，且其表达水平与胃癌浸润、转移程度呈正相关，而在体外上调miR-181a-5p的表达可显著促进胃癌细胞的增殖活性，提示miR-181a-5p在胃癌中起着类似促癌基因的作用。而本研究结果显示，乳腺癌细胞MDA-MB-23中miR-181a-5的表达明显低于HBL-100细胞(P＜0.05)；转染miR-181a-5p mimics可明显上调MDA-MB-231细胞中miR-181a-5p的表达，并对MDA-MB-231细胞增殖起到明显抑制作用，同时可阻碍细胞有丝分裂，使细胞阻滞于G2/M期，提示miR-181a-5p在乳腺癌中发挥着类似抑癌基因的功能。

Kras基因是表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)信号传导通路中重要的下游分子，而EGFR/Kras信号通路的激活是促进恶性肿瘤进展的重要基础[12-14]。大量临床研究证实，Kras在乳腺癌组织中呈高表达，且其高表达与肿瘤低分化、淋巴结转移及预后不良密切相关[15-18]，提示Kras在乳腺癌中起着促癌作用。Song等[19]通过体内及体外研究证实，采用miR-200c靶向抑制Kras表达可显著抑制乳腺癌细胞增殖，提高移植瘤小鼠存活率，进一步佐证了Kras在乳腺癌靶向治疗中的重要地位。本研究结果显示，乳腺癌细胞MDA-MB-231中Kras蛋白的表达明显高于HBL-100(P＜0.05)，转染miR-181a-5p mimics可使MDA-MB-231细胞中Kras蛋白表达明显下调，提示在MDA-MB-231细胞中，miR-181a-5p对Kras存在着某种负向调控机制。同时，随着Kras蛋白表达的下调，MDA-MB-231细胞增殖活性明显减弱，细胞凋亡比例明显增加，且细胞周期亦发生明显变化。双荧光素酶活性检测显示，miR-181a-5p可与Kras 3'-UTR特异性结合，降低荧光酶活性，进一步证实miR-181a-5p对Kras存在靶向作用，与既往研究一致[20]。

综上所述，本研究结果表明，乳腺癌细胞MDA-MB-231中miR-181a-5p呈低表达，Kras呈高表达；miR-181a-5p可通过靶向抑制Kras表达，实现对MDA-MB-231细胞增殖、凋亡及细胞周期的调控作用，是治疗乳腺癌的潜在靶基因。