α-硫辛酸对糖尿病大鼠肾脏miR-21和Smad7表达及纤维化的影响*

毛彦稳， 张小欢， 彭 伟， 刘慧铭， 刘玲伶, 王圆圆， 刘丽荣， 张莹莹， 张 帆， 石明隽， 肖 瑛， 汤 磊， 郭 兵△

(贵州医科大学 1病理生理学教研室， 2重大疾病发病机制及药物防治特色重点实验室， 贵州 贵阳 550025； 3贵州医科大学附属医院检验科， 4贵州医科大学药学院， 贵州 贵阳 550004)

在糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)的发生发展进程中，转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)可通过激活 Smads 信号通路诱导肾小管上皮细胞发生上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)并促进肾间质细胞外基质(extracel lular matrixc，ECM)的合成，进而造成广泛的肾组织纤维化[1-3]。Smad7作为抑制性Smad蛋白，可以抑制 TGF-1/Smads信号通路介导的生物学效应。本课题组在DN的纤维化进程中发现，Smad7蛋白表达显著下调，且伴有miR-21表达上调及TGF-β1/Smads 信号通路过度激活[4]。有研究发现，TGF-β1可以通过上调miR-21表达而下调Smad7蛋白水平，进而促进纤维化的发生发展[5]。

α-硫辛酸(alpha-lipoic acid，ALA)是一种含硫的抗氧化剂，可以清除活性氧簇，对氧化应激引起的组织损伤有治疗作用。而氧化应激也是DN的重要的发病因素之一，因此本研究通过观察抗氧化剂ALA对糖尿病(diabetes mellitus，DM)大鼠肾脏纤维化病变的影响，以miR-21和Smad7为靶点，探讨其可能的作用机制。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1实验动物 健康清洁级雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，体重(180±20) g，共24只，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，批号为SCXK(京) 2009-0004。

1.2主要试剂 ALA(奥立宝公司)；链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)及抗collagen I和collagen III单克隆抗体(Sigma)；抗Smad7和TGF-β1多克隆抗体(Santa Cruz)；抗β-actin抗体(Promed)；miR-21转录和real-time PCR试剂(广州锐博生物公司)；I 抗稀释液、ECL显色剂和BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物研究所)；Western blot用PVDF膜和3 mm Whatman滤纸(Millipore)。

1.3主要仪器 稳步倍加型血糖仪(强生公司)；超低温冰箱(Sanyo)；高速低温离心机、Bayer1650全自动生化分析仪(Beckman)；电泳系统及电转移装置(Amersham)；凝胶成像系统(Bio-Rad)；DP72显微镜(OLYPUMS)。

2 方法

2.1动物模型复制及分组 SD大鼠适应性喂养 1 周后，尾静脉注射溶于无菌柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH=4.5，0.01 mol/L)的STZ(55 mg/kg)，复制DM大鼠模型，72 h后测大鼠空腹血糖，血糖≥16.7 mmol/L且尿糖阳性认为造模成功，随机分成DM组和ALA组。成模后，采取灌胃方式给予ALA治疗，ALA溶于5%的羧甲基纤维素钠中，灌胃剂量为150 mg·kg-1·d-1，每周给药6 d，每3 d配药一次(4 ℃保存)；并设鼠龄相同的正常对照(normal control, NC)组，灌胃同等浓度同等剂量的羧甲基纤维素钠；给药6周后处死所有SD大鼠，期间所有大鼠予标准饲料喂养，自由饮水，每周监测 1 次血糖和体重。

2.2标本收集 大鼠处死前1 d用代谢笼收集24 h尿，记录尿量，取部分尿液离心后-20 ℃保存；处死前禁食6～8 h，乙醚麻醉后称重，股动脉穿刺采血，分离血清-20 ℃保存；开腹取双侧肾脏，去掉包膜及周围脂肪组织，称重记录肾重/体重指数(kidney weight/body weight，KW/BW)，分别用4%多聚甲醛固定及-80 ℃保存。

2.3生化指标测定 采用葡萄糖氧化酶法测血葡萄糖(blood glucose，BG)水平，酶分析法检测血总胆固醇(total cholesterol，TC)和甘油三酯(triglyceride，TG)水平；邻苯三酚红比色法测尿蛋白(urine protein，UP)含量，均按试剂盒说明书操作，尿蛋白浓度与尿量乘积为24 h UP。

2.4肾组织病理检查 多聚甲醛固定肾组织,制成3 μm厚的石蜡切片，行HE及Masson染色，用显微镜观察并采集图像，Masson染色结果运用Image-Pro Plus 6.0软件扫描图像并分析各图积分吸光度。

2.5Western blot检测蛋白水平 取-80 ℃保存的各组大鼠肾皮质，每只样本取200 mg， 分别加入组织蛋白提取液后匀浆离心取上清，用BCA试剂盒测定各组蛋白浓度，按所测得浓度计算每泳道所需体积，加入加样缓冲液煮沸10 min，经8%的SDS-PAGE分离，再转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，分别加入抗β-actin、Smad7、TGF-β1、 collagen I和collagen III抗体(稀释度分别为 1∶4 000、1∶300、1∶300、1∶1 000和1∶500)，4 ℃孵育过夜；次日，TBST洗膜后，加入相应的辣根过氧化物酶标记的 II 抗(稀释度均为1∶4 000)室温孵育1 h，加ECL荧光显色液，凝胶成像仪曝光，Image Lab软件分析各条带调整体积值，每个样本重复操作3次，以β-actin蛋白条带作为内参照，结果用目标蛋白/β-actin值表示。

2.6RT-qPCR实验 按天根公司试剂盒说明书，用 TRIzol法提取各组大鼠肾组织的总 RNA；以20 μL 反应体系反转录-聚合酶链反应合成cDNA，miR-21引物由生物工程有限公司合成，miR-21的上游引物序列为5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’，下游引物序列为5’-CAGCCCATCGACTGGTG-3’;U6的上游引物序列为5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物序列为5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’，采用Bio-Rad CFX 96荧光定量 PCR分析系统进行qPCR实验，结果以2-ΔΔCt法进行计算。

3 统计学处理

采用SPSS 17.0软件进行数据处理和统计分析。实验数据以均数±标准差(mean±SD)表示，组间比较采用方差齐性检验，方差齐时采用SNK-q检验；不齐时采用Games-Howell检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 生化指标检测结果

大鼠在注射STZ 72 h后，BG明显升高并持续在高水平。给药6周后，DM组的KW/BW、BG、TC、TG和24 h UP与NC组相比均显著升高(P<0.05)；与DM组相比，ALA组的KW/BW、TC、TG和24 h UP均降低(P<0.05)，而BG无明显变化，见表1。

表1各组大鼠肾重/体重指数和生化指标的变化

Table 1.The changes of the kidney weight/body weight (KW/BW), blood glucose (BG), 24-h urine protein (24 h UP), total cholesterol (TC) and triglyceride (TG) in each group after treatment with alphalipoic acid (ALA) for 6 weeks (Mean±SD.n=8)

GroupKW/BW (mg/g)BG (mmol/L)24 h UP (mg)TC (mmol/L)TG (mmol/L)NC7.09±0.445.38±1.033.02±0.491.37±0.191.39±0.33DM12.11±0.90*26.90±1.56*20.96±0.88*2.37±0.31*2.50±0.57*ALA10.57±0.56*#25.56±1.72*16.12±0.71*#1.50±0.31#1.47±0.40#

*P<0.05vsNC group;#P<0.05vsDM group.

2 肾组织的病理改变

HE及Masson染色可见NC组大鼠肾小管结构清晰，肾小管上皮细胞排列整齐，基底膜完整，间质未见炎性细胞浸润；DM组大鼠肾小管腔扩张明显，肾小管基底膜不规则增厚，肾小管上皮细胞出现空泡状改变，间质出现炎性细胞浸润，肾小管间质Masson染色阳性物质增多(P<0.05)；ALA组大鼠肾脏病变有不同程度的改善，肾小管间质Masson染色阳性物质明显减少(P<0.05)，炎性细胞浸润减轻，空泡状改变不明显，见图1、2。

3 Western blot结果

NC组中，Smad7高表达，而TGF-β1蛋白表达和Smad2/3的活化水平较低，即TGF-β1/Smads信号活化较少，collagen I 和 collagen III 仅有少量表达；DM组中Smad7表达水平较NC组显著下调(P<0.05)，而TGF-β1/Smads信号活化水平较正常组增加(P<0.05)，collagen I 和 collagen III 表达水平较NC组上调(P<0.05)；ALA组中Smad7表达水平与DM组相比上调(P<0.05)，TGF-β1/Smads信号活化水平较DM组降低(P<0.05)，collagen I 和 collagen III 表达水平较DM组下调(P<0.05)，见图3。

Figure 1.The morphological changes of the kidney tissues in each group after treatment with ALA for 6 weeks (HE staining).

图1HE染色观察各组大鼠肾组织形态的变化

Figure 2.The morphological changes of the kidney tissues in each group after treatment with ALA for 6 weeks (Masson staining). Mean±SD.n=8.*P<0.05vsNC group;#P<0.05vsDM group.

图2Masson染色观察各组大鼠肾组织形态的变化

4 RT-qPCR结果

与NC对照组相比，DM组大鼠肾组织的miR-21表达显著上调(P<0.05)；ALA干预后，miR-21的表达较DM组显著减少(P<0.05)，见图4。

讨 论

DN病是糖尿病的主要并发症之一，已经成为终末期肾病的首要病因，其主要病理改变特点为肾小球硬化和肾小管间质纤维化，可以表现为TGF-β1/Smads信号通路活化和ECM过度沉积[6-7]。本研究发现，大鼠肾组织中TGF-β1/Smads信号通路的活化水平与NC组比明显增加，并且伴随着胶原蛋白的大量沉积，肾脏纤维化明显。氧化应激被认为是造成糖尿病及其并发症的重要原因之一[8]。ALA作为一种抗氧化剂，可与其他抗氧化剂共同作用，对肾脏起到保护作用，作者主要探讨了ALA降低肾脏的氧化应激水平从而达到保护肾脏的保护作用[9]，但其深入的机制并不明确。本研究将着重从分子机制层面探讨ALA对肾脏的保护作用。

Figure 3.The protein levels of TGF-β1, Smad2/3, p-Smad2/3, Smad7, collagen III and collagen I in the kidney tissues of each group determined by Western blot. Mean±SD.n=8.*P<0.05vsNC group;#P<0.05vsDM group.

图3Westernblot显示各组大鼠肾组织中TGF-β1、Smad2/3、p-Smad2/3、Smad7、collagenIII和collagenI蛋白表达水平的变化

Figure 4.The expression level of miR-21 in the kidney tissues of each group. Mean±SD.n=8.*P<0.05vsNC group;#P<0.05vsDM group.

图4RT-qPCR结果显示各组大鼠肾组织中miR-21的表达水平

本研究结果显示，ALA组血糖没有明显变化，但病理学及生物化学检查显示纤维化病变程度显著减轻，且TGF-β1/Smads信号通路的活化水平降低，ECM沉积减少，表明ALA可以减少DM大鼠肾脏TGF-β1/Smads信号通路活化和ECM沉积，对DN有一定的抑制作用。TGF-β1/Smads信号通路参与了肾脏纤维化病变的发生发展过程中，可以调节多种因子的表达，其中包括 miRNAs[10-12]。本课题组前期研究发现，在并发 DN 的大鼠肾组织中，miR-21 表达显著上调[13]。Smad7 蛋白作为抑制性Smad，一方面可以对抗TGF-β1信号通路的效应[4]，另一方面Smad7又可以被TGF-β1信号通路所调控[5]。He等[5]在心肌纤维化疾病中发现，给予TGF-β1刺激之后，miR-21表达增多而Smad7表达减少，并进一步验证出Smad7是miR-21的一个靶基因，且TGF-β1可以通过上调miR-21的表达而下调Smad7的蛋白表达，导致TGF-β1/Smads通路过度活化，从而促进纤维化的发生发展。本研究中发现，与NC对照组相比，DM大鼠肾组织miR-21水平显著上调，而Smad7蛋白表达减少，纤维化病变明显；用ALA干预6周后，与DM组相比，miR-21表达下调，而Smad7随着miR-21表达的减少反而表达增多，纤维化病变减轻。表明在DN中，miR-21的增多和Smad7的减少促进了TGF-β1/Smads通路介导的胶原合成，加重纤维化病变程度；而ALA干预后，可以通过减少miR-21，恢复Smad7的蛋白表达，减少胶原的沉积，从而发挥保护肾脏的作用。

综上所述，ALA对DN的保护作用，可能是通过抑制TGF-β1/Smads信号通路的活化水平和miR-21的表达而上调Smad7蛋白表达，从而延缓肾脏纤维化的进程，最终对肾脏起到保护作用。