H2S对干旱胁迫下高山离子芥的作用研究

赵 敏 赵启安 刘 博 王玥萱 张莉环 杨 宁

(西北师范大学生命科学学院，兰州 730070)

干旱是最严重的逆境环境之一，植物的生长、发育和作物的产量均会受到干旱胁迫的影响，可能会直接导致农业经济损失巨大[1]。植物主要通过改变一系列的生理生化和分子机制来响应干旱胁迫[2]，而抗旱机制的研究也一直是国内外的热点。长期的进化过程中，植物通过干旱胁迫引起植物生理响应、形态结构、种子萌发等的变化，植物可通过降低生长速率、气孔导度、组织渗透势及提高抗氧化系统来抵御干旱胁迫的危害[3～4]。因此对植物开展干旱胁迫响应机制的研究，对植物的生长、农作物的稳产以及区域生态防御机制都具有重要的意义。

硫化氢(H2S)由于具有臭鸡蛋味，常被认为是有毒气体，现代研究已证实它是除一氧化氮(NO)、一氧化碳(CO)之外的第三种内源性气体信号分子[5]。H2S在哺乳动物体内含量较为丰富，已研究证实生理浓度的H2S可以作为一种细胞间信号传导的气态因子，在生理过程中扮演着重要角色，它的作用和NO、CO类似，具有调节血压、舒张血管等多种生理功能，它的代谢异常与心脑血管疾病密切相关[6]。在植物中，H2S主要通过内源酶促途径生成，L-半胱氨酸脱硫基酶(L-CDes)和D-半胱氨酸脱硫基酶(D-CDes)分别催化L-半胱氨酸(L-Cys)和D-半胱氨酸(D-Cys)产生H2S、氨和丙酮酸[7]。硫氢化钠(NaHS)常被用作H2S的外源供体，近年来有文献报道了生理浓度的NaHS可以促进种子发芽、根的形态建成[8～9]、调节花衰老[10]、保护多种植物抵御非生物胁迫，如干旱[11]、热[12]与重金属胁迫[13]等。

磷脂酶是位于细胞膜上可以水解磷脂酰胆碱的一类酶。根据其水解磷脂位置的不同，可划分为磷脂酶D(phospholipase D，PLD)、磷脂酶C(phospholipase C，PLC)、磷脂酶A1(phospholipase A1，PLA1)和磷脂酶A2(phospholipase A2，PLA2)[14]。PLD是催化磷酸二酯键水解和碱基交换反应的一类酶的总称，在许多生物类群中均有分布，如细菌到高等植物体中，具有参与脂质代谢，信号转导以及生物膜的形成等重要生理功能[15]。不同的PLD可特异性水解各种磷脂，磷脂酸(Phosphatidic acid，PA)作为直接产物，也是一种重要的信使物质，它是通过激活靶物质，使信号向下传导，同时，PA还可以进一步代谢产生其他物质[16]。有研究表明，PA可以和某些特异性蛋白结合，可参与NADPH氧化酶的活化[17]，与活性氧的产生也有关系。也有研究证实[18]，细胞膜系统是最先感知干旱信号，通过信号传导进入到细胞的内部，使植物产生一系列的生理响应，会产生大量的活性氧(ROS)，若不能及时清除会导致生物膜脂过氧化、引起蛋白质等大分子的交联对细胞产生伤害，其中过氧化氢(H2O2)是活性氧的一种，也是一种重要的信号分子。但在一定程度上，植物细胞自身会通过抗氧化酶系(超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)、过氧化氢酶(Catalase,CAT)、过氧化物酶(peroxidase,POD)来清除活性氧自由基，来减轻干旱对植物产生的伤害[19]，另外，当植物处于干旱环境时，会导致电解质渗漏率增加、渗透调节物质的改变，来增强植物的抗旱性[20]。

高山离子芥(Chorisporabungeana)是十字花科(Brassicaceae)离子芥属(Chorispora)的多年生草本植物，生长在高山冰缘地带，它与模式生物拟南芥(Arabidopsisthaliana)具有较高的同源性，其经常受到干旱、辐射、低温等多种非生物胁迫的影响，但是高山离子芥不具有发达的表皮毛和其它结构来抵御逆境胁迫，另外其叶在不同的营养、生殖生长阶段都有不同的形态结构，因此有学者认为高山离子芥具有独特的生理抗胁迫响应机制[21～22]。它作为一种天然的抗逆植物，对于研究高山冰缘植物独特的响应机制来说是一种很好的实验材料。本文选用高山离子芥试管苗为研究材料，以0.3 mol·L-1甘露醇模拟干旱胁迫，结合使用外源添加H2S供体NaHS、PLD下游产物PA及其抑制剂正丁醇和ROS抑制剂DPI，研究H2S对干旱胁迫下高山离子芥的膜系统损伤程度、渗透调节物质、抗氧化酶系、ROS、PLD活性以及内源H2S含量的影响，进而探讨PLD、ROS和H2S信号分子在高山离子芥中响应干旱胁迫中的信号作用及关系，为后期深入研究H2S在生态环境中可能的作用提供科学依据，以及揭示PLD、ROS、H2S响应干旱的信号通路奠定基础。

1 试验材料

1.1 高山离子芥试管苗的培养

高山离子芥试管苗的培养方法参考杨宁等的实验方法[23]，略有改动。具体操作如下：将高山离子芥(Chorasporabungeana)试管苗接种于MS+0.2 mg·L-16-BA+30 g·L-1蔗糖+5 g·L-1琼脂，pH5.8、温度23℃、光周期12 h、培养15 d后用于实验。

1.2 实验材料的处理

以0.3 mol·L-1甘露醇模拟干旱胁迫，各处理方式如下，NaHS处理：将150 μmol·L-1NaHS分别添加于培养基中，然后选择长势旺盛且生长一致的高山离子芥接种于培养基中；PA处理：将80 μmol·L-1PA分别添加于培养基中；H2O2处理：将1 mmol·L-1H2O2添加于培养基中；PA+H2O2：将80 μmol·L-1PA和1 mmol·L-1H2O2添加于培养基中；PA+DPI：将80 μmol·L-1PA和10 μmol·L-1DPI添加于培养基中；正丁醇+H2O2处理：将0.2%正丁醇和1 mmol·L-1H2O2添加于培养基中；正丁醇+DPI处理：将0.2%正丁醇和10 μmol·L-1DPI添加于培养基中，然后选择生长一致，长势旺盛的高山离子芥分别接种于0.3 mol·L-1甘露醇培养基中，置于光照培养架上。以上处理每瓶至少接种3株，每处理3个平行。处理时间为6、12、24、48、72 h。实验以0 h作为空白对照，未添加甘露醇处理的作为阴性对照组，添加甘露醇处理的处理组为实验组，待胁迫处理结束后，取高山离子芥叶片为材料进行实验。

2 试验方法

2.1 干旱胁迫下高山离子芥试管苗膜系统损伤程度指标测定

2.1.1 相对电导率(EL)的测定

相对电导率(EL)的测定参照Walker等的方法[24]。分别称取不同处理的新鲜高山离子芥试管苗0.2 g，用超纯水快速冲洗3次，置于5 mL超纯水中，室温25℃静置2 h，使用电导仪测得C1，之后沸水浴30 min，待冷却至室温后用电导仪测得C2。设3个重复。

相对电导率：EL(%)=C1/C2×100%

(1)

2.1.2 丙二醛(MDA)含量的测定

MDA的测定方法采用硫代巴比妥酸法，参考Amako等的方法并略有改动[25]，简述如下，称取0.2 g经处理的幼苗，加入10%三氯乙酸2 mL，研磨成匀浆，4 000 r·min-1离心10 min。取1 mL上清液，加入0.6% TBA 1 mL，溶液95℃水浴15 min后迅速冷却，分别在450、532和600 nm测其吸光度值，重复3次，计算公式如下：

MDA浓度(μmol·mL-1)=6.45×(OD532-OD600)-0.56×OD450

(2)

MDA含量(μg·g-1)=提取液中MDA浓度(μmol·mL-1)×提取液体积(mL)/幼苗鲜重(g)

(3)

2.2 干旱胁迫下高山离子芥试管苗叶片中渗透调节物质测定

2.2.1 脯氨酸含量的测定

脯氨酸含量的测定采用磺基水杨酸法[26]，具体方法如下，准确称取不同处理的待测植物叶片各0.2 g，加入2 mL 3%磺基水杨酸研磨，吸取至10 mL离心管中，4℃条件下离心10 min，取上清液，沸水浴10 min。冷却后取上清液1 mL，分别加入1 mL蒸馏水、1 mL冰乙酸、2 mL 2.5%酸性茚三酮溶液，然后沸水浴中孵育60 min。冷却后加入2 mL甲苯萃取，震荡30 s后静置，分层后取甲苯相在分光光度计上520 nm下测定OD值，计算脯氨酸的含量。

2.2.2 可溶性糖的测定

采用蒽酮比色法[27]测定可溶性糖含量，准确称取不同处理的待测植物叶片各0.2 g，加入2 mL蒸馏水研磨，吸取至10 mL离心管中，4℃下离心10 min，取上清液0.5 mL，加入1.5 mL蒸馏水，再分别加入0.5 mL蒽酮乙酸乙酯和5 mL浓H2SO4，以蒸馏水为空白对照，震荡沸水浴1 min，冷却后630 nm下测定OD值，计算可溶性糖含量。

2.3 干旱胁迫下高山离子芥试管苗叶片中抗氧化酶系测定

2.3.1 超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定

超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定采用氮蓝四唑(NBT)法[28]，以抑制NBT光化学还原的50%为一个酶活单位(U)，酶的活性以U·g-1·min-1表示。

2.3.2 过氧化物酶(POD)活性的测定

过氧化物酶(POD)活性的测定参照愈创木酚显色法测定[28]，以每分钟OD470升高0.01为一个酶活单位(U)，酶活性以U·g-1·min-1表示。

2.3.3 过氧化氢酶(CAT)活性的测定

过氧化氢酶(CAT)活性的测定参照Cakmak等[29]方法测定，以每分钟OD240减少0.01为一个酶活单位(U)，活性以U·g-1·min-1表示。

2.4 PLD、H2S、H2O2含量以及O·-2含量的测定

PLD酶活性、H2S含量由上海酶联生物公司的试剂盒测定，具体测定方法参照试剂盒说明书。H2O2含量测定参照Li等[30]方法测定，略有改动，称取新鲜高山离子芥叶片0.2 g，加入4℃下预冷的丙酮和少许石英砂研磨成匀浆后，3 000 r·min-1离心10 min，弃去残渣，吸取上清1 mL，分别加入0.1 mL 5%硫酸钛和0.2 mL浓氨水，待沉淀形成后离心10 min，弃去上清液。沉淀用丙酮反复洗涤3～5次，直到去除植物色素，加入2 mmol·L-1硫酸5 mL，待沉淀完全溶解后，415 nm下测定。O·-2含量测定参照李忠光等[31]方法测定，称取0.2 g不同处理的新鲜高山离子芥叶片，加入0.05 mol·mL-1的磷酸钾缓冲液(pH7.8)2 mL及少许石英砂，充分冰浴研磨，将匀浆液置于2 mL离心管中于8 000 r·min-1离心10 min，取上清液1.5 mL加入0.5 mL磷酸钾缓冲液(pH7.8)和10 mmol·mL-1盐酸羟胺0.1 mL，摇匀后25℃水浴10 min。取出后加入58 mmol·mL-1氨基苯磺酸1 mL、7 mmol·mL-1α-萘胺1 mL，30℃水浴30 min，最后加3 mL氯仿，10 000 r·min-1离心3 min，小心吸取上层粉色水相，室温A530 nm下测定。

2.5 数据统计

数据采用SPSS 17.0对组间随时间变化的差异性多重比较采用LSD法分析，作图在Orgin pro 9.0中进行，每次实验均独立重复3次。

3 结果与分析

3.1 外源添加H2S供体NaHS浓度的筛选

相对电导率(EL)和丙二醛含量(MDA)能够反映干旱胁迫下植物细胞膜的损伤程度。如图1所示，与对照组相比，0.3 mol·L-1甘露醇处理下EL和MDA含量显著上升，表明干旱胁迫会对高山离子芥试管苗细胞膜产生损伤；然而，当外源添加一定生理浓度(≤0.2 mmol·L-1)的NaHS时，EL和MDA显著下降，表明外源H2S的加入对干旱胁迫下高山离子芥试管苗细胞膜具有一定的保护作用，减轻膜脂过氧化程度。但当浓度增大到一定程度时，会对其产生毒害作用。其中，外源NaHS浓度为0.15 mmol·L-1时，EL、MDA较对照下降最为明显，因此选择0.15 mmol·L-1为后续实验外源添加NaHS的浓度。

图1 0.3 mol·L-1甘露醇处理下不同浓度的NaHS对高山离子芥试管苗中相对电导率、丙二醛含量的影响Fig.1 Effect of different concentrations of NaHS on Relative Electricity and malondialdehyde content in C.bungeana plantlets under 0.3 mol·L-1 mannitol

图2 干旱胁迫下，H2S对高山离子芥试管苗相对电导率(A)、丙二醛含量(B)的影响 图中小写字母表示同一时间不同浓度在P≤0.05时的显著性差异，大写字母表示不同时间同一浓度在P≤0.05时的显著性差异，下同。Fig.2 Effect of H2S on the relative conductivity(A) and malondialdehyde(B) in C.bungeana plantlets under drought stress The lower case letters indicate the same time different concentrations at P≤0.05 when the significant difference between the capital letters that the same concentrations at the different time in the P≤0.05 significant difference,the same as below.

图3 干旱胁迫下，外源H2S对高山离子芥试管苗脯氨酸含量(A)、可溶性糖含量(B)的影响Fig.3 Effect of H2S on proline content(A) and soluble sugar content(B) in C.bungeana plantlets under drought stress

图4 干旱胁迫下，外源H2S对高山离子芥试管苗SOD活性(A)、POD活性(B)、CAT活性(C)的影响Fig.4 Effect of exogenous H2S on SOD activity(A),POD activity(B) and CAT activity(C) in C.bungeana plantlets under drought stress

3.2 干旱胁迫下H2S对高山离子芥试管苗膜系统损伤程度的影响

图2A表明，相对电导率随着干旱胁迫时间的延长而逐渐增加，在48 h有下降趋势，但都显著高于阴性对照组，但当外源添加H2S时，干旱胁迫下相对电导率显著下降，表明H2S可能对干旱下细胞膜透性有一定的保护作用。

干旱胁迫可诱导MDA含量的显著变化(图2B)，在干旱处理6～72 h时间内，MDA含量呈先升高后下降趋势，在24 h时达到最大值，外源添加H2S后，干旱胁迫下MDA含量与对照相比呈显著下降趋势，说明H2S会降低干旱胁迫下膜脂过氧化程度。

3.3 干旱胁迫下，H2S对高山离子芥试管苗叶片中渗透调节物质的影响

干旱胁迫下外源H2S对高山离子芥的脯氨酸和可溶性糖含量测定显示，在干旱胁迫6～72 h内，脯氨酸含量(图3A)呈上升趋势，并且始终高于对照组，且在48h时达到最大值。通过外源施加NaHS，脯氨酸含量显著提高，72 h时达到最大。可溶性糖含量(图3B)随胁迫时间的延长呈波动趋势，在24 h达到最大值。添施NaHS后，可溶性糖含量显著高于0.3 mol·L-1甘露醇处理，胁迫后期的下降可能是植物作出的适应性反应。植物脯氨酸含量、可溶性糖在细胞质中大量积累有利于抵抗逆境环境的影响，防止原生质脱水，平衡细胞质与液泡间的渗透势。外源H2S可增加高山离子芥试管苗叶片中脯氨酸含量、可溶性糖以抵御干旱胁迫造成的植物损伤。

3.4 干旱胁迫下H2S对高山离子芥试管苗叶片中抗氧化酶系的影响

SOD、POD、CAT等是植物对膜脂过氧化的酶促防御系统的重要酶，这些酶具有抗氧化作用，其活性提高与抵御逆境胁迫和抑制细胞膜脂过氧化等相关。如图4所示，0.3 mol·L-1干旱胁迫单独处理时，SOD、POD、CAT的活性均呈升高趋势，有利于抵御干旱胁迫导致的高山离子芥试管苗的氧化损伤。用0.15 mmol·L-1NaHS处理干旱胁迫下高山离子芥试管苗，不同处理时间下SOD活性变化如图4A所示，干旱胁迫导致高山离子芥试管苗SOD活性增加，并表现为胁迫初期上升，后期有所下降；说明随着干旱胁迫时间的延长，高山离子芥试管苗的抗氧化能力下降。而外施H2S进一步诱导了SOD活性的上升，表明H2S可以提高干旱胁迫下高山离子芥试管苗的抗氧化能力。

图4B表示干旱胁迫下，外源H2S对POD活性的影响，在胁迫早期，POD活性对干旱不敏感，胁迫12 h后，干旱诱导POD活性增加，在24 h达到最大值。外源添加H2S后，极大程度诱导POD活性，表明H2S可能是通过增强POD活性从而抵御干旱胁迫对高山离子芥试管苗造成的氧化损伤。

图4C所示，CAT参与了整个干旱胁迫过程，在胁迫12 h时CAT活性达到最大值，随着胁迫时间的延长，CAT活性又会受到抑制，但始终显著高于对照组。外源H2S诱导CAT活性，使CAT活性显著高于0.3 mol·L-1甘露醇单处理，表明H2S增强酶促作用来增强高山离子芥试管苗抗旱能力。

3.5 干旱胁迫对高山离子芥试管苗中PLD活性、H2S含量变化的影响

干旱胁迫下PLD活性随处理时间的变化如图5A所示，从图5中可以看出，在不同的干旱胁迫时间下，PLD活性均显著高于空白对照组。与对照组相比，0.3 mol·L-1甘露醇处理6～72 h，PLD活性在12 h达到最大，为85.78%，且PLD活性整体呈波动变化趋势，分别在72 h最低，12 h达到最高值。由图5B可知，高山离子芥试管苗叶片中可产生内源H2S，干旱胁迫可诱导高山离子芥叶片H2S含量的增加，且H2S含量在胁迫48h后达到最大值，较对照增高141.23%，由此得出H2S响应干旱胁迫。

图6 干旱胁迫下，外源H2S对高山离子芥试管苗H2O2含量(A)、O·-2含量(B)、的影响Fig.6 Effect of exogenous H2S on H2O2 content(A),O·-2 content(B) in C.bungeana plantlets under drought stress

图7 干旱胁迫下外源PA、正丁醇对高山离子芥试管苗中H2O2含量(A)、O·-2含量(B)的影响Fig.7 Effects of exogenous PA,1-butanol on H2O2 content(A),O·-2 content(B) in C.bungeana plantlets under drought stress

3.6 干旱胁迫下，H2S对高山离子芥试管苗叶片中活性氧(ROS)的影响

如图6所示，外源H2S对干旱胁迫下ROS产生具有积极作用。图6A所示，干旱胁迫下H2O2含量显著上升，胁迫24 h达到最大值，约为空白对照组的4倍。外施NaHS后，H2O2含量显著下降，处理48 h时较干旱胁迫相比下降50.46%。干旱胁迫下，外源H2S对高山离子芥试管苗O·-2含量的影响如图6B所示，干旱胁迫激活O·-2的应答，在处理时间内显著上升，胁迫6 h时，O·-2含量上升最低，48 h达到最大值，外施NaHS后，干旱胁迫下O·-2含量得到不同程度的降低，6～72 h内，分别降低34.38%，31.36%，46.39%，39.42%，45.13%。表明一定浓度的H2S可以不同程度的抑制干旱胁迫下ROS的积累，缓解干旱胁迫引起的氧化损伤。

3.7 干旱胁迫下外源PA、正丁醇对高山离子芥试管苗中ROS的影响

图5～6的结果表明，ROS、PLD活性和H2S含量均能积极应答干旱胁迫，说明三者之间可能存在一定的联系。通过外源添加PLD下游产物磷脂酸(PA)以及PLD抑制剂正丁醇，研究PLD对ROS的影响。结果如图7所示，外源添加PA显著增加干旱胁迫下H2O2含量、O·-2含量，而外源添加正丁醇后，H2O2含量、O·-2含量得到显著降低，说明PA参与ROS的生成，PLD可能位于ROS上游发挥作用。

3.8 干旱胁迫下外源PA、DPI、正丁醇对高山离子芥试管苗中H2S含量的影响

二联苯碘(DiphenyleneIodonium，DPI)是NADPH氧化酶抑制剂，而NADPH氧化酶是ROS产生的主要途径，通过外源添加DPI可抑制ROS的产生。采用外源添加PA、DPI和正丁醇，研究干旱胁迫下，PLD、ROS、H2S三者之间的联系。如图8所示，分别外源添加PA、H2O2均可显著促进干旱胁迫下H2S的释放，初步说明PA、ROS与干旱胁迫下H2S的产生密切相关，PLD、ROS可能均位于H2S的上游发挥作用，当同时外援施加PA和DPI后，干旱胁迫下H2S含量没有显著变化，说明PLD下游产物PA影响H2S的产生依赖于ROS，当同时外源施加PLD抑制剂正丁醇与DPI后，显著抑制干旱胁迫下H2S含量的产生，进一步表明干旱胁迫诱导的H2S产生需要PLD与ROS的参与，由此表明ROS位于PLD上游，位于H2S下游发挥作用。

图8 干旱胁迫下外源PA、DPI、正丁醇对高山离子芥试管苗中H2S含量的影响Fig.8 Effect of exogenous PA,DPI and 1-butanol on the content of H2S in C.bungeana plantlets under drought stress

4 讨论

干旱是重要的非生物胁迫之一，可影响细胞膜完整性，参与渗透调节并能影响光合能力变化等，是植物生长发育的主要限制因素，严重的干旱胁迫降低作物的生产，并可能导致作物灾难性的欠收[32]，因此研究干旱条件下植物的抗旱机制具有重要意义。植物PLD是一类位于质膜上的磷脂水解酶，有关研究表明[33]植物遭受逆境环境时可激活PLD，可引起植物膜系统磷脂降解产生PA，PA可作为第二信使参与调控植物的生长发育。植物内源H2S主要以L/D-Cys为底物，通过半胱氨酸脱巯基酶(CDes)的催化产生的。H2S可参与植物生长发育和生物及非生物胁迫应答中重要的气体信号分子，且NaHS被常用于植物H2S供体研究，参与多种胁迫应答过程，例如外源H2S缓解铝胁迫对大麦的生长抑制[34]。干旱胁迫下植物体内会合成大量ROS，导致生物膜脂过氧化，在一定程度上植物又会产生ROS清除剂(SOD、POD、CAT)来清除ROS自由基，以减轻干旱对细胞造成的损伤[35]。已有研究表明[36]，由PLD/PA介导的脂质信号会调节暴露于短期和长期低温胁迫下大麦幼苗中H2O2水平。H2S通过上调抗氧化酶活性来减轻由Cd胁迫引起的细胞死亡，以去除过量的活性氧物质并减少细胞氧化损伤[37]，但是关于高山冰缘植物PLD、ROS与H2S信号研究国内外未见有相关报道。本文主要以干旱胁迫响应过程中H2S调节高山离子芥的膜系统损伤程度、渗透调节物质和抗氧化酶系中的作用，以及干旱胁迫下PLD、ROS与H2S信号分子在高山离子芥中的作用和可能存在的信号关系进行研究，为深入研究干旱胁迫下H2S在高山离子芥中的信号作用奠定了一定的基础。

细胞膜是具有选择透过性半透膜，在一些逆境条件下如干旱、低温等细胞膜会受损，造成植物细胞损伤，检测细胞膜相对透性变化的指标就是相对电导率(EL)。丙二醛(MDA)是膜脂过氧化的主要产物之一，是长期以来用于间接反应细胞损伤程度的一个重要指标[38]。本研究结果发现，0.3 mol·L-1甘露醇模拟的干旱条件下，相对电导率显著增加，当外源添加NaHS后，干旱胁迫下相对电导率有所下降(图2A)，表明外源H2S在一定程度上可保护细胞膜透性，避免细胞内的电解质外渗。这与柏桂生等的研究[39]H2S可降低Cd胁迫下小麦种子的质膜透性结果相似。也有研究表明[40]，在干旱胁迫下未经NaHS处理植物幼苗中的MDA含量上升幅度始终高于NaHS处理，且MDA含量随着干旱胁迫时间延长而逐渐上升。本文实验结果与其相一致，干旱胁迫可诱导MDA含量的显著变化(图2B)，高山离子芥细胞膜质过氧化程度随胁迫时间延长而增加，通过外源添加NaHS后，干旱胁迫下MDA含量与对照相比均显著下降，说明外源H2S能够降低干旱胁迫下膜脂过氧化程度，减少MDA的产生从而降低对植物的伤害，缓解干旱胁迫对高山离子芥的不利影响。

干旱胁迫下植物通过积累渗透调节物质来维持蛋白质水化程度来减轻干旱对植物造成的伤害[41]在本研究中干旱诱导脯氨酸含量(图3A)、可溶性糖含量(图3B)积累，在干旱胁迫时间内，脯氨酸含量、可溶性糖含量均呈上升趋势，表明干旱诱导渗透调节物质发生改变来应答所处的逆境环境。干旱胁迫下，通过外源添加NaHS后，脯氨酸含量、可溶性糖含量显著高于0.3 mol·L-1甘露醇单处理，胁迫后期的下降可能是高山离子芥对干旱前期的抗旱锻炼，对干旱作出的适应性反应。

干旱胁迫也会造成植物细胞内活性氧(ROS)爆发，造成膜脂过氧化进而损害植物细胞，植物为了清除累积的ROS则会启动抗氧化酶清除系统如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)来清除植物体内多余的活性氧，抑制膜脂过氧化作用，从而保护植物细胞膜结构，使植物减轻甚至免受逆境胁迫的伤害[42]。本研究结果表明，外源H2S抑制干旱胁迫下高山离子芥ROS的产生，如图6所示，H2O2含量(图6A)、O·-2含量(图6B)均能够积极响应干旱胁迫，H2O2含量达到最大值的时间早于O·-2含量，可能是因为H2O2是产生O·-2的前体所致。通过外源添加NaHS，干旱胁迫下H2O2含量、O·-2含量得到不同程度的降低，说明一定浓度的NaHS处理可以不同程度的减少干旱胁迫下ROS的积累，缓解干旱胁迫引起的氧化损伤，这与Shi等[43]的研究结果外源NaHS可以缓解胁迫并增强植物耐受性，且H2S上调了多种非生物和生物胁迫相关基因的转录物，与抑制活性氧(ROS)积累的实验结果一致。

干旱胁迫下，抗氧化酶系(SOD、POD和CAT)参与整个胁迫过程(图4)，随着处理时间的延长呈现波动趋势，胁迫后期有下降趋势，说明随着干旱胁迫时间的延长，高山离子芥试管苗的抗氧化能力下降，但均显著高于对照组，其中SOD和MDA达到最大值的时间相类似，进一步证明了干旱胁迫下抗氧化酶不能及时清除ROS导致膜脂过氧化作用加强，导致更多的电解质外漏，对高山离子芥试管苗造成伤害。外源添加H2S后，SOD、POD和CAT活性均有不同程度的提高，表明H2S可以提高干旱胁迫下高山离子芥试管苗的抗氧化能力，且NaHS处理下，3种酶可能在清除过量ROS过程中起到协同互补作用来增强高山离子芥试管苗抗旱能力。

已知ROS(图6)、PLD活性和H2S含量(图5)均能积极应答干旱胁迫，暗示三者之间可能存在某种联系。通过外源添加PLD下游产物磷脂酸(PA)以及PLD抑制剂正丁醇，研究PLD对ROS的影响。如图7所示，外源添加PA能够显著增加干旱胁迫下H2O2含量和O·-2含量，而外源添加正丁醇后，H2O2含量和O·-2含量显著降低，说明ROS的产生与PA有关，PLD可能位于ROS上游发挥作用。二联苯碘DPI可抑制ROS的产生，通过外施PA、DPI、正丁醇，研究干旱胁迫下，PLD、ROS和H2S三者之间的联系。图8表明，分别外源添加PA、H2O2均可显著促进干旱胁迫下H2S的释放，表明干旱胁迫下H2S的产生与PLD、ROS有关，又如图6所示，外源H2S会抑制ROS产生来缓解干旱胁迫造成的氧化损伤，另一方面，外源添加ROS供体H2O2又会显著促进H2S的释放，表明H2S与ROS的信号关系不单单是简单的线性关系。当同时外源添加PA与DPI后，DPI将ROS抑制后，干旱胁迫下H2S含量没有显著变化，说明PLD影响H2S的产生依赖于ROS，当外源同时添加正丁醇与DPI后，PLD与ROS都抑制后，干旱胁迫下H2S含量显著下降，进一步表明干旱胁迫诱导的H2S产生与PLD、ROS密切相关，且ROS位于PLD上游，且位于H2S下游发挥作用(图9)。

图9 H2S调节干旱胁迫下高山离子芥的抗旱模式图Fig.9 A model showing the H2S regulated rought-resistance of C.bungeana plantlets under drought stress

H2S响应干旱胁迫下高山离子芥的作用如图9所示，H2S会显著降低干旱胁迫对高山离子芥试管苗细胞膜系统损伤程度、提高渗透调节物质与抗氧化酶系、抑制ROS产生，从而增强高山离子芥的抗旱能力；信号分子H2S、PLD活性和ROS对干旱胁迫均能做出响应，干旱胁迫下，高山离子芥中ROS位于PLD的下游、H2S的上游发挥作用。后期将对信号分子H2S、PLD以及抗氧化酶合成基因等在干旱胁迫下的作用机制继续进行深入研究，为进一步研究植物的抗旱机制提供部分依据。