水曲柳FmMUR5基因的克隆及表达模式的分析

王恒涛 邵婉璇 徐舒浩 曾凡锁

(东北林业大学生命科学学院，哈尔滨 150040)

植物细胞壁是参与细胞和组织的形态，生长和发育以及植物及其病原体之间的相互作用的动态结构。细胞壁是人类膳食纤维的来源，也是许多家畜的营养来源。植物细胞壁也是用于生产燃料和其他化学物质的生物质的可再生资源。细胞壁多糖主要有纤维素、半纤维素及果胶等，这些多糖多由葡萄糖醛酸、阿拉伯糖醛酸等单糖衍生物在一系列酶催化下合成，核苷糖是多糖合成的活化底物。在核苷糖合成途径中，尿苷二磷酸—阿拉伯吡喃糖变位酶(UDP-Arabinopyranose mutase或UAM或MUR5)可以催化UDP-阿拉伯吡喃糖(UDP-Arap)和UDP-阿拉伯呋喃糖(UDP-Araf)之间的相互转化[1～3]。

UAM首先在水稻种子提取物中被鉴定，该酶显示出能够催化UDP-阿拉伯吡喃糖(UDP-Arap)和UDP-阿拉伯呋喃糖(UDP-Araf)之间的相互转化。已经在各种植物物种中鉴定了编码这些植物变位酶的基因，其中包括绿藻(Chlamydomonasreinhardtii)，苔藓(小立碗藓)，各种双子叶植物和单子叶植物。Konishi等人发现UAM酶的序列与之前已经被指定为可逆糖基化多肽(RGP)的直系同源基因和蛋白质匹配，即植物UAM属于称为可逆糖基化多肽(RGPs)的小基因家族[4～7]。基因敲除研究已经表明UAM活性在拟南芥细胞中的重要性。在具有AtRGP1和AtRGP2基因敲除的细胞系中观察到总的叶的细胞壁阿拉伯糖含量降30%。此外，抑制这些基因导致细胞壁阿拉伯糖含量降低80%，并且UAM的活性降低至野生型1%[4～5]。Sumiyoshi等人的研究表明OsUAM3在生殖组织中表达，并参与花粉细胞壁的生物合成[8]。Konishi等人使用RNA干扰(RNAi)来下调OsUAM基因表达水稻(Oryzasativa)，证明这导致细胞壁中Araf的量减少6%～44%，阿拉伯糖含量降低大于25%以上的转基因水稻矮化和不育[9]。Rautengarten等人证明UDP-Arap和UDP-Araf的相互转化对于细胞壁建立和植物发育是必需的[5]。然而，尿苷二磷酸—阿拉伯吡喃糖变位酶催化UDP-Arap和UDP-Araf相互转化的机制尚未确定。另外，对核苷糖转换基因的调控等相关研究还不深入。

水曲柳(Fraxinusmandshurica)为木犀科(Oleaceae)梣属(Fraxinus)(又称为白蜡属)植物，属于古老树种中的残遗植物[10]。水曲柳材质坚韧，纹理美观，是东北、华北地区的珍贵用材树种，可制各种家具、乐器、体育器具、车船、机械及特种建筑材料，其收藏价值及使用价值前景较高。该研究利用RT-PCR克隆水曲柳FmMUR5基因，并利用生物信息学软件对该基因进行分析，应用实时定量PCR(Real-time PCR)对该基因在水曲柳不同时间和不同部位进行表达分析，并且使用实时定量PCR对经受低温(4℃)、盐(NaCl)和甘露醇3种非生物胁迫的水曲柳幼苗中进行表达模式的分析，利用实时定量PCR对使用脱落酸(ABA)、生长素(IAA)和赤霉素(GA)3种植物激素处理的水曲柳幼苗进行表达模式的分析，以揭示FmMUR5在非生物胁迫和植物激素信号诱导下的表达特征并为深入研究水曲柳FmMUR5基因在细胞壁合成中的作用提供基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料及处理

在东北林业大学实验林场随机选取水曲柳作为实验材料。并在5～9月随机选取了水曲柳皮、木质部、新生枝、花、芽、叶、叶柄、种子样本用于测定相关基因的表达量。并且取水曲柳15 d幼苗，分别用低温(4℃)、NaCl(200 mmol·L-1)、甘露醇(200 mmol·L-1)、ABA(脱落酸，100 μmol·L-1)、GA(赤霉素，100 μmol·L-1)和IAA(吲哚乙酸，100 μmol·L-1)处理，对照组没有做任何处理，然后水曲柳幼苗在正常的条件下继续培养，分别在处理的1、3、6、12和24 h取样，并且每个重复3次。所有的样品都储存在-80℃的冰箱中待用。

1.2 实验方法

1.2.1 FmMUR5基因的克隆

提取水曲柳总RNA的方法为CTAB法[11]，利用逆转录试剂盒将可用的RNA逆转录成cDNA；利用已经获得的水曲柳转录组数据，设计简并引物(FmMUR5-F：5′CAACTCAATCCCTATCCCCA3′FmMUR5-R：5′CTGTCAAAAGAGAATGATAACGC3′)，利用PCR扩增FmMUR5的cDNA。扩增程序为94℃ 5 min;94℃ 30 s,56℃ 30 s,72℃ 1.5 min,30cycles;72℃ 10 min。用1.0%琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，回收并纯化后与PEASY-T5-Zero cloning kib载体连接，热激转化大肠杆菌Transl-T，分别挑选多个独立的阳性克隆进行菌落PCR鉴定，送生物公司进行测序。

1.2.2 FmMUR5基因的生物信息学分析

利用DNAMAN软件对获得的水曲柳FmMUR5基因进行核苷酸序列的分析，并检测其编码蛋白质氨基酸序列。利用Protparam[11]在线软件分析FmMUR5蛋白质的基本理化性质。利用ProtScale[12]在线软件分析FmMUR5蛋白质亲水疏水性。利用SignalP[13]在线软件分析FmMUR5基因是否具有分泌蛋白所需的疏水性N端信号肽。FmMUR5蛋白质的跨膜结构应用在线工具TMPred[14]进行预测及分析。FmMUR5蛋白的二级结构应用GOR4软件分析[15～16]。利用NCBI数据库中的Blast对FmMUR5氨基酸序列进行同源序列比对，然后选择不同物种中的同源氨基酸序列。首先使用ClustalX对氨基酸序列进行多序列比对，再利用MEGA5.0软件的Neighbor-Joining算法构造出系统发育进化树[16～17]。

1.2.3 FmMUR5的转录表达定量分析

将不同月份不同部位以及不同处理的水曲柳材料利用CTAB法提取RNA，将检测可用的RNA反转录成cDNA。将稀释10倍的cDNA作为模板，实时定量使用TOYOBO(SYBR Green)试剂盒，体系为20 μL:无菌蒸馏水：6.8 μL，上下游引物各0.4 μL，2×TransStart Top Green qPCR SuperMix:10 μL，Passive Reference Dye(50×):0.4 μL，cDNA模板2 μL。利用ABI 7500荧光定量PCR仪进行定量PCR，反应程序：94℃ 30 s，94℃ 5 s，60℃ 30 s，(40cycles)95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。每份品重复3次。利用2-ΔΔCt法和2-ΔCt法对目的基因相对表达水平进行运算，公式中的ΔΔCT=(CT靶基因-CT内参)处理组-(CT靶基因-CT内参)对照组，ΔCT=(CT靶基因-CT内参)。

2 结果与分析

2.1 氨基酸序列理化性质分析及蛋白质二级结构域的预测

我们克隆的FmMUR5编码区全长1 080 bp,编码359个氨基酸。应用在线分析软件Protparam对FmMUR5基因编码的蛋白质的基本理化性质进行分析。FmMUR5蛋白分子量是40 669.66;不稳定系数为30.41(不稳定系数小于40时，预测蛋白质稳定，反之为不稳定)，为稳定类蛋白；预测的理论等电点(pI)是5.82；蛋白总的平均疏水性是-0.278，表明蛋白质是亲水性蛋白。

FmMUR5蛋白含有18.38%的α螺旋(Alphahelix)、23.12%的延伸链(Extandedstrand)和58.50%的无规则卷曲(Randomcoil)。

2.2 信号肽及跨膜结构的预测和分析

信号肽位于蛋白质的N端，一般由16～26个氨基酸残基组成，其中包括疏水核心区、信号肽的C端和N端等3部分[18]。利用SignalP在线软件对FmMUR5蛋白进行分析。结果如图1所示，FmMUR5蛋白不存在信号肽。

图1 FmMUR5蛋白信号肽的预测和分析 C.原始剪切位点的分数；S.信号肽的分数；Y.综合剪切位点的分数Fig.1 Prediction and analysis of FmMUR5 protein signal peptide C.Raw cleavage site score; S.Signal peptide score; Y.Synthetic shear site score

图2 FmMUR5蛋白跨膜结构域的预测和分析Fig.2 Prediction and analysis of FmMUR5 protein transmembrane domain

跨膜结构是含一个19个疏水氨基酸残基的肽段，它卷曲成一个α螺旋，N端是长的亲水结构，C端是较短的亲水结构[19]。应用TMPred在线软件对FmMUR5蛋白质的跨膜结构进行分析进行跨膜结构分析，结果显示，FmMUR5蛋白可能含有一个跨膜结构域，跨膜螺旋位于第194和第213个氨基酸之间并且总共包含19个氨基酸，方向为o→i，分数为135(分数>500为显著跨膜结构)。由此可见，FmMUR5蛋白不存在跨膜结构。

2.3 氨基酸序列比对及系统进化树构建

先利用NCBI对FmMUR5氨基酸序列进行同源比对，再利用MEGA5.0软件构建系统进化树，结果显示，FmMUR5蛋白与樟子松(Oleaeuropaeavar.sylvestris)、乌拉尔小麦(Triticumurartu)、大麦

(Hordeumvulgare)、核桃(Juglansregia)、麻风树(Jatrophacurcas)等物种的同源蛋白序列有高度的保守性。

系统进化树的构建是为了描述不同物种之间的进化关系[20]。结果表明，22条蛋白序列大致分为两个大类：其中樟子松(Oleaeuropaeavar.sylvestris)、乌拉尔小麦(Triticumurartu)、大麦(Hordeumvulgare)和水曲柳聚成一条分支，黄灯笼辣椒(Capsicumchinense)、马铃薯(Solanumtuberosum)、番茄(Solanumlycopersicum)、核桃(Juglansregia)、芝麻(Sesamumindicum)、陆地棉(Gossypiumhirsutum)、甜辣椒(Capsicumannuum)、风铃辣椒(Capsicumbaccatum)、美花烟草(Nicotianasylvestris)、野生烟草(Nicotianaattenuate)、番木瓜(Caricapapaya)、圆果种黄麻(Corchoruscapsularis)、无油樟(Amborellatrichopoda)、紫花风铃木(Handroanthusimpetiginosus)、麻风树(Jatrophacurcas)、橡胶树(Heveabrasiliensis)和梅(Prunusmume)等成另一条分支。水曲柳FmMUR5蛋白与樟子松有较近的遗传距离，可以认为它们有更近的亲缘关系；而与黄灯笼辣椒、野生烟草、番茄和芝麻等有着较远的遗传距离，可以认为它们有更远的亲缘关系。

图3 FmMUR5基因系统发育进化树Fig.3 FmMUR5 gene phylogenetic tree

2.4 FmMUR5在水曲柳中的表达模式

2.4.1 FmMUR5在水曲柳中的时空表达

对水曲柳的叶、叶柄、新生枝、木质部、皮、种子、花、芽取材进行荧光定量PCR，通过绘制热图分析FmMUR5基因表达水平(红色表示表达量高，绿色表示表达量低)。从热图中可以看出，水曲柳FmMUR5基因在各个月份的新生枝中表达量最高，说明水曲柳FmMUR5基因具有组织特异性；并且各部位在八月份表达都比较高，而叶、叶柄、新生枝、种子在七月份表达也比较高。在不同部位的基因表达量来看(均于五月份取的样：花、芽为五月八号取材，其余的于五月二十二号取材)，水曲柳FmMUR5基因在新生枝中的表达量最高，其次，在花和种子表达也比较显著。

图4 水曲柳FmMUR5基因不同部位的表达量Fig.4 The expression of different parts of FmMUR5 gene in F.mandshurica

部位Position五月May六月June七月July八月Aug九月Sep叶Leaf0.463510.1831481.6931221.5265970.699355叶柄Petiole0.1725530.529421.8531316.7221041.450163新生枝Fresh branches54.6212742.9654840.0694426.0031946.70088木质部Xylem0.8188320.893290.7008141.3960970.697623皮Bark1.2170010.5042210.9211218.9441710.754253种子Seed8.6571811.05913310.330568.6638683.83689

图5水曲柳FmMUR5基因表达的热图及原始数据

Fig.5HeatmapandrawdataofFmMUR5geneexpressioninF.mandshurica

2.4.2 非生物胁迫下FmMUR5在水曲柳中的表达

不同细胞壁组分的功能以及它们与外源刺激如病原体和环境胁迫之间的相互作用多年来一直受到关注，特别是在寻找可以实现病原抗性，耐胁迫和提高作物产量的机制方面[21]。非生物胁迫处理下，FmMUR5基因的表达量随处理时间的增长而呈现出波动的现象。低温处理中，FmMUR5基因的表达水平在处理1 h时达到峰值，约为对照组的1.5倍，随后随着处理时间的增长，该基因表达水平不断下降，在处理24 h时表达量达到最低，约为对照组的6%；在NaCl处理下，FmMUR5基因的表达量也是在处理1 h时达到峰值，约为对照组的1.4倍，随后表达量下调，在处理12 h时表达量最低，约为对照组的13%；在甘露醇(Mannitol)处理下，FmMUR5基因表达量也是在处理1 h时达到峰值，约为对照组的6.3倍，随后表达量下降，在处理12 h时表达量又有略微升高，在处理24 h时表达量又下降，达到最低，约为对照组的44%。说明水曲柳FmMUR5基因对这3种非生物胁迫有响应。

图6 FmMUR5在非生物胁迫下的相对表达量Fig.6 FmMUR5 relative expression in abiotic stress

图7 FmMUR5基因在植物激素信号下的相对表达量Fig.7 FmMUR5 relative expression in plant hormone signal

2.4.3激素信号诱导下FmMUR5在水曲柳中的表达

ABA处理中，FmMUR5基因的表达水平在处理1 h时达到峰值，约为对照组的2.5倍，随后表达水平降低，但在处理6 h时又有所升高，随后下降，在处理24 h时表达量最低，约为对照组的7%；在IAA的处理下，FmMUR5基因的表达量在处理1 h时达到峰值，约为对照组的3.8倍，随后表达量有所降低，在处理6 h时表达量达到最低，约为对照组的16%；在GA的处理下，FmMUR5基因随处理的时间出现的变化不明显，在处理12 h后表达量达到最高，约为对照组的1.1倍，在处理6 h后表达量最低，约为对照组的67%。说明水曲柳FmMUR5基因明显响应ABA和IAA信号刺激，但对GA的信号刺激响应不明显。

3 讨论

利用在线软件及工具对FmMUR5蛋白的预测及生物信息学分析的结果显示，FmMUR5蛋白是一种稳定的亲水性蛋白，可能不含有指导蛋白质跨膜转移的信号肽和跨膜结构；二级结构的预测与分析显示，FmMUR5蛋白只含有α-螺旋、延伸链、无规则卷曲；利用NCBI数据库中的BLASTP对FmMUR5氨基酸序列的比对分析结果显示，水曲柳FmMUR5蛋白与樟子松、马铃薯、大麦、芝麻、陆地棉等物种同源蛋白序列有高度的保守性；利用比对结果构造的系统进化树显示，水曲柳FmMUR5蛋白与樟子松、大麦、乌拉尔小麦等聚成一大类，说明它们在进化亲缘关系上比较近。

细胞壁多糖主要有纤维素、半纤维素及果胶等，Reiter等人认为UDP-糖互变途径为半纤维素和果胶生物合成提供了主要底物，尿苷二磷酸—阿拉伯吡喃糖变位酶(MUR5)可以催化UDP-Arap和UDP-Araf相互转化[22～25]。转录水平的定量分析显示FmMUR5基因在水曲柳不同部位不同发育时期均有表达，但在新生枝中表达量最高，可见水曲柳FmMUR5基因具有组织特异性，可能原因是在新生枝的生长发育过程中纤维素、半纤维素含量增加，细胞壁加厚，而FmMUR5在细胞壁多糖的活化底物核苷糖的合成途径中起作用，间接地调控多糖的合成。

细胞壁是一个活跃的结构，参与植物发育的关键阶段和在外源性胁迫下的细胞信号[26]。细胞壁具有一定的灵活性，使得当其受到发育，生物或非生物刺激时，可以迅速地对其进行改造，编码能够合成或水解植物细胞壁组分的酶的基因在受到不同的胁迫时表现出差异表达，表明它们可以通过改变细胞壁组成来促进胁迫耐受性[21]。非生物胁迫是限制植物生长及产量的全球性问题[27]。低温是影响野生植物和农作物的生产力的一个重要因素[28]。因此研究和抗寒机制相关的基因也变得越来越有意义。在本研究中，低温处理下，FmMUR5基因的表达水平在处理1 h时达到峰值，约为对照组的1.5倍，随后随着处理时间的增长，该基因表达水平不断下降，在处理24 h时表达量达到最低，约为对照组的6%；说明FmMUR5基因响应了低温胁迫。另外，在NaCl处理下，FmMUR5基因的表达量也是在处理1 h时达到峰值，约为对照组的1.4倍，随后表达量下调，在处理12 h时表达量最低，约为对照组的13%；在甘露醇(Mannitol)处理下，FmMUR5基因表达量也是在处理1 h时达到峰值，约为对照组的6.3倍，随后表达量下降，在处理12 h时表达量又有略微升高，在处理24 h时表达量又下降，达到最低，约为对照组的44%。说明FmMUR5基因也响应了盐胁迫和干旱胁迫。在感知环境胁迫信号后，植物细胞壁可以对各种环境胁迫做出应答[29]。植物对环境的适应以及对逆境的应答最终会在细胞壁的成分和结构上体现出来。我们推测水曲柳幼苗通过增加FmMUR5的表达量，使核苷糖合成加快，间接增加细胞壁多糖来应答这些环境胁迫。

ABA与GA两种植物激素在植物多种生长发育与逆境调节过程中起到调节作用[30]。而植物激素生长素(IAA)几乎调节植物发育的各个方面[31]。在本研究中，ABA处理中，FmMUR5基因的表达水平在处理1 h时达到峰值，约为对照组的2.5倍，随后表达水平降低，但在处理6 h时又有所升高，随后下降，在处理24 h时表达量最低，约为对照组的7%；在IAA的处理下，FmMUR5基因的表达量在处理1 h时达到峰值，约为对照组的3.8倍，随后表达量有所降低，在处理6 h时表达量达到最低，约为对照组的16%；在GA的处理下，FmMUR5基因随处理的时间出现的变化不明显，在处理12 h后表达量达到最高，约为对照组的1.1倍，在处理6 h后表达量最低，约为对照组的67%。这些结果意味着FmMUR5基因对这3种植物激素信号诱导有响应。到目前为止，很多植物激素被发现可以影响植物次生细胞壁的形态和构成，暗示其可能参与纤维素、半纤维素和木质素合成基因的表达调控[32]。FmMUR5基因在植物激素信号诱导下表达量上升,可能原因是植物通过增加FmMUR5的表达量，进而间接增加细胞壁多糖来对植物激素做出应答。

综上所述，可以说明低温、干旱和盐等非生物胁迫以及植物激素ABA、IAA和GA对水曲柳FmMUR5基因的表达有一定影响。本研究为进一步研究水曲柳FmMUR5基因对非生物胁迫及植物激素信号诱导的响应的机制和调控奠定了基础。