注射用丹参多酚酸盐在大鼠脑缺血再灌注损伤中的作用机制

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缺血性脑血管病是最常见的脑血管病之一。脑缺血区由中心缺血区和周围缺血半暗带组成。缺血半暗带是脑卒中治疗的靶点，如果采取有效治疗，可挽救缺血半暗带濒临死亡脑组织[1]。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是血管内皮细胞特异性促有丝分裂源，能够与血管内皮细胞上的特异性受体结合，可促进毛细血管生成，而毛细血管生成可恢复缺血区脑组织血液供应[2]。注射用丹参多酚酸盐是从丹参中提取的丹参多酚酸盐类化合物，主要成分是丹参乙酸镁，具有改善微循环、抗栓、抗氧化、抗炎和抑制缺血再灌注损伤等作用[3]。以往研究证实，丹参多酚酸盐能缩小大鼠局部脑缺血后脑梗死面积，并可延长低压缺氧小鼠存活时间[4-5]。本实验采用大鼠大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型，观察注射用丹参多酚酸盐在大鼠脑缺血再灌注损伤中的神经保护作用；并通过检测脑缺血半暗带VEGF变化，探讨丹参多酚酸盐的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 72只健康雄性SD大鼠(体重330 g左右)，由西安交通大学医学院动物实验中心提供。大鼠昼夜循环光照，自由饮水和进食。

1.2 药物及试剂 丹参多酚酸盐(上海绿谷生物公司)；2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC，上海化学试剂公司)；兔抗大鼠VEGF(武汉博士德生物工程有限公司)；山羊抗兔二抗和DAB试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.3 大鼠MCAO模型制备及分组 MCAO模型制备采用改良Longa法[6]，采取尼龙线线栓法夹闭大鼠左侧颈内动脉。颈部正中切口3 cm～4 cm，分离皮下组织，暴露左侧颈总动脉，结扎左侧颈总动脉近心端和远心端，用眼科剪在左侧颈总动脉上剪一斜口，插入栓线，直至遇到阻力且栓线进入18 mm～20 mm，缝合皮下组织及皮肤，建立MCAO模型。局灶性脑缺血为MCAO 48 h；局灶性脑缺血再灌注为MCAO 2 h后再灌注48 h(MCAO/R)。Sham组手术步骤同MCAO，但不行血管内插入栓线。大鼠随机分为6组：Ⅰ组(Sham+生理盐水)、Ⅱ组(Sham+丹参多酚酸盐)、Ⅲ组(MCAO+生理盐水)、Ⅳ组(MCAO+丹参多酚酸盐)、Ⅴ组(MCAO/R +生理盐水)和Ⅵ组(MCAO/R+丹参多酚酸盐)。注射用丹参多酚酸盐溶于生理盐水，浓度3 mg/mL。每只大鼠腹腔注射2.0 mL～2.4 mL生理盐水或丹参多酚酸盐，注射2 d，每日2次。

1.4 神经行为学评分 在大鼠MCAO或MCAO/R后48 h进行神经功能评分，0分：无神经功能缺损症状；1分：提尾时病灶对侧前肢不能完全伸直；2分：向病灶对侧转圈征象；3分：向病灶对侧倾倒；4分：不能自发行走及意识丧失。

1.5 TTC染色 神经行为学评分后，将大鼠断头取脑，-20 ℃冷冻15 min后进行冠状切片，脑片1.5 mm厚，将脑片置于1% TTC磷酸盐缓冲液(PBS)中，暗室孵育10 min，正常脑组织可染为深红色，脑梗死区不染色。根据文献[7]方法计算各组大鼠的脑梗死体积。

1.6 免疫组化 将大鼠脑组织在4%多聚甲醛中固定，随后分别在20%、30%蔗糖中存放至沉底。将脑组织用OCT包埋，冰冻切片机切20 μm脑片，脑片用丙酮浸泡20 min，PBS洗3次，再用甲醛30 mL+PBS 10 mL+30% H2O2500 μL浸泡10 min，PBS洗3次。应用二步法进行免疫组化检测：兔抗大鼠VEGF抗体(1∶1 000)室温孵育6 h ，PBS洗3次，加山羊抗兔二抗，室温孵育1 h，PBS洗3次，DAB显色，裱片，梯度脱水，透明，中性树胶封片。每张切片在高倍视野下随机选取5个视野，观察每个视野VEGF阳性细胞数，取平均数。

2 结 果

2.1 各组大鼠神经功能评分比较 大鼠神经功能评分显示，Ⅰ组和Ⅱ组大鼠神经学表现基本正常，神经行为学评分均为12.50分；与Ⅰ组、Ⅱ组比较，Ⅲ组和Ⅳ组大鼠神经学评分明显增高(P<0.05)；与Ⅲ组和Ⅳ组相比，Ⅴ组和Ⅵ组大鼠神经学评分明显降低(P<0.05)，而且Ⅵ组低于Ⅴ组，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表1。

表1 各组大鼠神经功能评分情况

2.2 各组大鼠脑梗死体积比较 TTC染色显示，Ⅰ组和Ⅱ组大鼠脑切片染色为均匀红色，无缺血灶；Ⅲ组和Ⅳ组大鼠有明显局灶性脑缺血。与Ⅲ组和Ⅳ组相比，Ⅴ组和Ⅵ组大鼠脑梗死体积明显减少(P<0.05)，且Ⅵ组梗死体积小于Ⅴ组，差异有统计学意义(P<0.05)。详见图1、表2。

图1 各组大鼠大脑TTC染色

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2.3 各组大鼠脑缺血半暗带VEGF表达比较 免疫组化结果显示，各组大鼠相关脑区均存在VEGF阳性表达，Ⅰ组和Ⅱ组比较差异无统计学意义(P>0.05)；与Ⅰ组和Ⅱ组相比，Ⅲ组和Ⅳ组VEGF阳性表达均增加(P<0.01)，且Ⅳ组较Ⅲ组VEGF阳性表达增加(P<0.05)；与Ⅰ组和Ⅱ组相比，Ⅴ组和Ⅵ组VEGF阳性表达均增加(P<0.05)，且Ⅵ组较Ⅴ组增高，差异有统计学意义(P<0.01)。详见图2、表3。

图2 各组大鼠大脑免疫组化染色情况

组别nVEGF阳性表达Ⅰ组621.33±4.18Ⅱ组622.17±5.12Ⅲ组639.50±7.011)Ⅳ组648.67±7.341)2)Ⅴ组637.17±6.881)Ⅵ组649.33±8.071)3) 与Ⅰ组、Ⅱ组比较,1)P<0.01;Ⅳ组与Ⅲ组比较,2)P<0.05;Ⅵ组与Ⅴ组比较,3)P<0.01。

3 讨 论

缺血性脑血管病极大地危害着人们健康。在脑缺血时存在多种脑损伤疾病的病理生理，如何减轻脑缺血后神经损伤，一直是临床研究的重点和难点。临床研究证实，注射用丹参多酚酸盐可改善脑卒中病人神经功能缺损，增加脑血管流量[8]，但是其作用机制仍不明确。本研究通过评估丹参多酚酸盐对脑缺血再灌注损伤大鼠神经功能评分和脑梗死体积的影响，观察丹参多酚酸盐对大鼠急性期脑损伤的神经保护作用，并检测大鼠脑缺血半暗带VEGF表达，探讨丹参多酚酸盐可能的作用机制。

研究结果显示，大鼠MCAO或MCAO/R后神经学评分及脑梗死体积均明显增高，而腹腔注射丹参多酚酸盐可改善大鼠MCAO或MCAO/R后大鼠神经学评分，缩小脑梗死体积。正常生理情况下，由于大鼠血脑屏障的存在，绝大多数药物较难通过血脑屏障，但是在脑缺血性损伤时，其通透性将增高，难以通过血脑屏障药物就可以进入脑组织[9]。近年来相关研究表明，脑组织损伤后可出现再塑性，神经元发生机制与血管再通有密切关联，所以血管生成为脑损伤修复提供了新的靶点[10]。脑缺血再灌注损伤后，促进血管生成可能与以下因素有关，包括生长因子和黏附分子等。其中最具代表性的生长因子是VEGF。VEGF是一种特异血管内皮细胞有丝分裂素，可诱导血管生成，还可促进神经再生，并抑制细胞凋亡[11]。目前已经证实，缺血性脑损伤能上调神经元VEGF表达[12]，这与本研究结果一致。最近有研究报道，创伤性脑损伤小鼠模型中侧脑室注射一定剂量VEGF，能改善神经行为学功能，主要表现为神经细胞凋亡减少，同时血管密度增加[13]。上述研究提示，VEGF既有血管形成作用，又有神经营养作用。本研究中，MCAO介导的脑缺血再灌注大鼠的血脑屏障遭到破坏，丹参多酚酸盐可通过血脑屏障，作用于缺血半暗带，通过上调该区域VEGF表达，从而对濒临坏死的神经细胞发挥神经保护作用。

综上所述，丹参多酚酸盐可能通过VEGF在大鼠脑缺血再灌注损伤中发挥神经保护作用。