靶向EGFR抗体融合UL16结合蛋白2激活NK细胞治疗结直肠癌的体内外研究

文家治

结直肠癌(colorectal cancer，CRC) 是全球常见的恶性肿瘤，大约有20 %的结直肠癌发展为转移性结直肠癌，其患者5年内生存率仅仅不到10 %。结直肠癌传统的治疗方法为手术、化学治疗和放射治疗，但都存在着靶向性低、细胞毒性大等缺点[1-2]。表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)是临床上研究比较多的一个肿瘤治疗靶点，EGFR和其相应的配体结合后，结合为同源二聚体,也可以与其他TK受体结合从而激活细胞内TK区,通过启动一系列级联反应最终抑制肿瘤细胞增殖和凋亡,促进肿瘤细胞发生转移，并且能够耐受放疗和化疗等治疗,所以，EGFR在肿瘤发生以及发展过程中发挥重要作用。据相关文献报道，EGFR在胰腺癌、胃癌、结直肠癌、卵巢癌等恶性肿瘤中高表达,在肿瘤发生和发展过程中扮演着重要角色，其通过阻断EGFR 信号可抑制肿瘤细胞的增殖[3-4]。NK 细胞表面活化性受体(natural killer cell activating receptor,NKG2D)是一种NK 细胞、CD8 + T 细胞、NKT 细胞等免疫细胞表面的蛋白。而UL16 结合蛋白(unique long 16-binding proteins,ULBP)是NKG2D 的一种配体,据相关文献表明 ULBP蛋白参与了机体对肺癌、胃癌及宫颈癌的免疫过程，NK细胞可通过识别结直肠癌细胞表面ULBP3，通过NKG2D介导的杀伤效应来清除肿瘤细胞[5-6]。本研究主要探究靶向EGFR抗体融合UL16结合蛋白2激活NK细胞治疗结直肠癌的体内外活性。

1 材料与方法

1.1 材料

DMEM培养基以及胎牛血清FBS购于赛默飞世尔公司(美国)；PBS和双抗(青霉素和链霉素)购于普洛立德生物科技有限公司；蛋白Marker 购于金斯瑞生物科技有限公司;FITC-标记的羊抗人IgG抗体购于南京赛博生物公司;细胞培养瓶以及细胞实验相关耗材购于赛业生物科技有限公司；CytoTox96 非放射性细胞毒性试剂盒购于普洛麦格(北京)生物技术有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1 目标融合蛋白的表达以及纯化 在GeneBank中搜索靶向EGFR的抗体-西妥昔单抗的基因和UL16结合蛋白2的基因，合成后利用G4S柔性肽把两者进行连接，构建重组质粒，然后使用毕赤酵母X-33表达系统进行表达。将上一步得到的发酵液通过硫酸铵沉淀法进行提取，然后再采用Protein A以及层析柱法进一步将蛋白分离纯化，然后通过Western blot对得到的蛋白进行鉴定，从而获得产量高以及纯度高的目标融合蛋白。

1.2.2 通过流式细胞仪测定目标融合蛋白与HCT116细胞的结合 将HCT116细胞充分分散在培养基中，每组分散成106的单细胞悬液。将上述细胞细胞悬液分为西妥昔单抗组、目标融合蛋白组以及空白脱脂牛奶对照组。在西妥昔单抗组细胞中加入250 μL浓度为200 μg/mL西妥昔单抗抗体，在目标融合蛋白组细胞中加入250 μL浓度为200 μg/mL目标融合蛋白，在空白对照组细胞中加入250 μL脱脂牛奶，3组在冰上进行孵育1 h，然后用PBS进行洗涤，用FITC-标记的羊抗人IgG抗体进行孵育，用PBS进行洗涤，将3组分别上机进行检测。使用Foxtable2017对数据进行处理分析。

1.2.3 MTT法 取对数期HCT116细胞，计数，调整细胞浓度至4×104个/mL。96孔板用PBS液封，每孔取100 μL细胞悬液种板，37 ℃、5 % CO2培养。12 h后待细胞贴壁后，给药。每孔加入配制好的西妥昔单抗或目标融合蛋白液体50 μL，每个浓度设6个复孔，空白背景组和空白对照组补加50 μL DEPC水，37 ℃、5 % CO2条件下继续培养48 h。48 h后，每孔加25 μL MTT工作液，左右前后摇晃均匀，37 ℃孵育4 h。4 h后4 000 rpm 离心10 min。小心吸出每孔培养基。每孔加入DMSO 150 μL，用微型振荡器震荡(500 r，10 min)。在酶标仪上测定吸光度(OD)值，选取检测波长为570 nm，测定其OD值，并计算细胞存活率。细胞存活率(%)=(实验组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)×100%。上述实验重复3次。

1.2.4 ADCC法测定目标融合蛋白激活NK细胞杀伤肿瘤细胞的能力 选用NK92细胞作为效应细胞，靶细胞是HCT116细胞。实验组设置了NK92细胞与HCT116细胞不同比值的各个实验组，比值分别为1∶1、1∶50、100∶1，5种对照组(靶细胞自发LDH释放、效应细胞自发LDH释放、靶细胞最大LDH释放、培养基背景对照以及裂解液体积校正对照组)，每组设置3 个复孔。按照试剂盒步骤将各种检测试剂混合加入到细胞毒检测板中，然后放在37 ℃培养箱中，孵育4 h;孵育结束后，用移液枪移取10 μL细胞裂解液加入到靶细胞最大释放孔内，裂解45 min后，收集上清液;孵育4 h之后，用离心机250 g进行离心4 min;然后用移液枪吸取50 μL每孔中的上清液加入到一块新的96 孔板中相对应的孔；然后在每孔中加入对应的底物中，然后在室温下进行避光孵育30 min。然后在每孔加入50 μL终止液进行终止;在1 h内必须进行检测，在492 nm波长测定各孔的吸光值。细胞毒性=(实验组吸收值-效应细胞自发释放吸收值-靶细胞自发释放吸收值) /(靶细胞最大释放吸收值-靶细胞自发释放吸收值)×100。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 高纯度目标融合蛋白的获得

西妥昔单抗和ULBP分别合成之后，然后通过PCR技术将西妥昔单和ULBP连接重组后，将Cetuximab-ULBP导入质粒中，通过毕赤酵母X-33进行表达。经过纯化后，并且利用Western blot验证后确定我们得到了高纯度且构象正确的融合蛋白(靶向EGFR抗体融合UL16结合蛋白2)。

2.2 流式细胞仪测定目标融合蛋白和HCT116细胞的结合能力

靶向EGFR受体的西妥昔单抗和靶向EGFR抗体融合UL16结合蛋白2可与HCT116细胞表面相结合。流式细胞仪测定结果表明：西妥昔单抗和HCT1167细胞的结合率为79.21%，而靶向EGFR抗体融合UL16结合蛋白2和HCT1167细胞的结合率为73.53%，这表明了本研究制备的目标抗体仍然保持了母体抗体结合HCT116细胞的活性。

2.3 MTT结果

本研究通过MTT实验测定目标融合蛋白对结直肠癌细胞HCT116的增殖抑制活性。MTT实验结果如表1所示，和对照组相比较，西妥昔单抗组和目标融合蛋白组对HCT116细胞的增殖均有抑制作用，并且呈浓度依赖性。西妥昔单抗组抑制HCT116细胞增殖率为73.76%，目标融合蛋白组抑制HCT116细胞增殖率为71.98%，两者活性相当。MTT实验结果表明了我们制备的目标融合蛋白仍保留了西妥昔单抗抑制肿瘤细胞增殖的活性。另外，本实验还通过MTT法测定了不同浓度下西妥昔单抗和目标融合蛋白的抗肿瘤活性，从表1可以看出两者的抗肿瘤活性相当，并且抗肿瘤活性呈浓度依赖性。

表1 MTT法测定西妥昔单抗组和目标融合蛋白组对HCT116细胞的抑制率/%

2.4 ADCC实验结果

本实验制备的目标融合蛋白同时具备人IgGl抗体上完整的Fc片段和可以激活NK细胞的NKG2D片段，目标融合蛋白能够通过以上2种途径增强NK细胞、中性粒细胞等效应细胞杀伤结直肠癌细胞，增强目标融合蛋白(Cetuximab-ULBP)的ADCC作用。选用NK92细胞作为效应细胞，结直肠癌HCT116细胞作为靶细胞进行杀伤实验，检测目标融合蛋白(Cetuximab-ULBP)对这种杀伤作用的增强效果。结果显示(表2)，Cetuximab-ULBP能显著增强结直肠癌HCT116细胞的杀伤作用。选用NK92细胞作为为效应细胞，当Cetuximab和ULBP效靶比为100∶1时，西妥昔单抗和Cetuximab-ULBP都能够增强NK92的杀伤HCT116肿瘤细胞的作用，其中Cetuximab-ULBP组的细胞裂解率为(45.34±7.14)%，而西妥昔单抗组的细胞裂解率是(38.24±6.11)%，两者比较，具有统计学差异(P<0.05)。原因主要是目标融合蛋白可以与结肠癌细胞结合，从而将NKG2D分子固定结合在结肠癌细胞的表面，从而诱导NK92和靶细胞之间发生相互作用，最终激活NK92细胞起到杀伤结肠癌细胞的作用。

表2 ADCC实验检测各组细胞裂解率

注：*为与对照组相比,P<0.05;#为与西妥昔单抗组相比,P<0.05。

3 讨论

近年来EGFR是临床上肿瘤治疗的新靶点，临床实验发现EGFR在结直肠癌等多种肿瘤细胞表面表达，并且在肿瘤细胞的发生以及发展过程中发挥重要作用。根据相关文献研究表明，通过抑制EGFR的表达，能够起到抗肿瘤的作用，在肿瘤治疗中具有良好的研究前景[7-8]。ULBP是一种可以激活NK细胞的配基,ULBP蛋白参与了机体对肺癌、胃癌及宫颈癌的免疫过程，NK细胞可通过识别结直肠癌细胞表面ULBP3，可以通过NKG2D介导的杀伤效应来清除肿瘤细胞，从而使肿瘤细胞脱离免疫逃逸[9-10]。本实验将具有靶向性的抗体和ULBP分子相结合，具有靶向性的抗体能够靶向到结直肠癌胞表面的特异性受体，起到抗肿瘤作用，并且还可以通过NKG2D介导的杀伤效应来清除肿瘤细胞，重塑机体NK细胞的杀伤作用，从而实现靶向双重抗肿瘤的作用。

本研究成功地构建并且表达目标融合蛋白靶向EGFR抗体融合UL16结合蛋白2，并且成功克隆目标融合蛋Cetuximab-ULBP；通过Western blot实验结果验证了目标融合蛋白的正确表达以及成功装配。通过体外抗肿瘤活性实验结果表明我们的融合蛋白并没有丧失抗体西妥昔单抗对HCT116肿瘤细胞原有的抗肿瘤活性，通过流式细胞仪实验结果表明我们的融合蛋白并没有丧失抗体西妥昔单抗对HCT116肿瘤细胞原有的结合能力。ADCC实验结果表明，和单一亲本抗体进行相比较，本研究构建的目标融合蛋白Cetuximab-ULBP介导NK细胞等免疫细胞的作用更强，从而起到抗肿瘤细胞的作用，这是由于我们的目标融合蛋白能够成功地将ULBP靶向到结直肠癌肿瘤细胞表面，存在NK细胞表面的活化型受体NKG2D成功被ULBP激活，从而发挥了NK细胞介导地对结直肠癌细胞的免疫杀伤作用。Cetuximab-ULBP还可以通过Fc段及MICB段的介导，存在协同杀伤肿瘤细胞的效果。

综上所述，与单一西妥昔单抗相比，靶向EGFR抗体融合UL16结合蛋白2通过介导免疫细胞杀伤肿瘤细胞而增强其抗肿瘤活性，在临床上可作为一种结直肠癌治疗的新方法。