婴幼儿配方奶粉中维生素B1的检测及其衍生物稳定性的研究

倪炜华，陈妍，边国军

（嘉兴市食品药品检验检测院，浙江嘉兴314000）

0 引言

维生素B1又称硫胺素或抗神经炎维生素或抗脚气病维生素，为白色结晶或结晶性粉末，由嘧啶环和噻唑环通过亚甲基结合而成的一种B族维生素[1]。维生素B1主要存在于种子的外皮和胚芽中，如米糠和麸皮中含量很丰富，在酵母菌中含量也极丰富[2]。瘦肉、白菜和芹菜中含量也较丰富。所用的维生素B1都是化学合成的产品。在体内，维生素B1以辅酶形式参与糖的分解代谢，有保护神经系统的作用；还能促进肠胃蠕动，增加食欲[3]。维生素B1缺乏时，可引起多种神经炎症，如脚气病[4]。维生素B1缺乏所引起的多发性神经炎，患者的周围神经末梢有发炎和退化现象，并伴有四肢麻木、肌肉萎缩、心力衰竭、下肢水肿等症状[5-6]。在现代医学上，维生素B1制剂治疗脚气病和多种神经炎症有显著疗效。

目前测定奶粉中维生素B1的方法主要有：荧光分光光度法[7-8]、液相色谱法[9-10]、高效液相色谱质谱联用法[11]。新版国标方法GB 5009.84-2016《食品安全国家标准食品中维生素B1的测定》第一法中指出衍生物在室温条件下4 h内稳定[12]，这给我们日常的批量检测带来了一定的难度。本文通过建立测定婴幼儿配方奶粉中维生素B1的高效液相色谱法，并对其衍生产物的稳定性进行研究，找到一个适合批量检测的方法。

1 试验

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪，Agilent 1200型，美国Agilent公司；电子分析天平，BS210S型，德国赛多利斯公司；p H计，FE20型，梅特勒-托利多仪器有限公司；立式灭菌锅，LMQ.C/3885型，山东新华医疗器械有限公司；生化培养箱，SPX-400-型，上海跃进医疗器械有限公司。

维生素B1，纯度为95.7%，德国D rEhrenstorfer公司；木瓜蛋白酶，酶活力大于600 U/m g，国药集团化学试剂有限公司；淀粉酶，酶活力大于4 000 U/g，上海鼓臣生物技术有限公司；甲醇，HPLC级，德国M erck公司；正丁醇，HPLC级，国药集团化学试剂有限公司；冰乙酸，HPLC级，美国TED IA公司；氢氧化钠，优级纯，永华化学科技有限公司；铁氰化钾，分析纯，上海强顺化学试剂有限公司；盐酸，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；实验用水为超纯水；样品奶粉，市售。

1.2 实验条件

色谱柱：色谱柱为Agilent公司的SB C 18(150 mm×4.6 mm×5μm)；柱温：30℃；进样体积：20μL；流动相：甲醇：0.05 mol/L乙酸钠溶液=35∶65；流速：1.0 mL/min；检测波长：激发波长375 nm,发射波长435 nm。

1.3 样品处理

提取准确称取5 g匀质样品（准确到0.0001g）于250 mL锥形瓶中，加60 m L0.1 mol/L盐酸溶液，充分摇匀，塞上软质塞子，高压灭菌锅中121℃保持30 min。水解结束待冷却至40℃以下取出，轻摇数次，用pH计指示，用2.0 mol/L乙酸钠溶液调节pH至4.0左右,加入2.0 mL混合酶（1.76 g木瓜蛋白酶、1.27 g淀粉酶,加水定容至50 mL）溶液，摇匀后，置于培养箱中37℃过夜(约16 h)。将酶解液全部转移至100 mL容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀，用滤纸过滤,取上清液备用。

准确移取上述滤液2.0 mL于10 mL试管中，加入1.0 mL碱性铁氰化钾溶液（将5 mL 20 g/L铁氰化钾溶液与200 mL 100 g/L氢氧化钠溶液混合）,涡旋混匀后，准确加入2.0 mL正丁醇，再次涡旋混匀后静置约10 min，待充分分层后,吸取正丁醇相(上层)经0.22μm有机滤膜过滤，取滤液于进样瓶中。另取2.0 mL标准系列工作液,与试液同步进行衍生化，过0.22μm有机滤膜，供HPLC测定。

2 结果与讨论

2.1 衍生产物稳定性的研究

用本方法分别对雅培婴儿配方奶粉，较大婴儿配方奶粉，幼儿配方奶粉中的维生素B1进行含量的测定。同时对维生素B1衍生产物在一定条件下，一定时间段内的峰面积进行比较，主要有棕色进样瓶与透明进样瓶，冷藏与室温，以及在7 d之内选取9个时间点，在相同仪器条件下，对峰面积进行测定，并对数据进行统计学分析。具体情况见表1。

通过表1可以看到，维生素B1在衍生后，保存条件对其影响不大，在16 h内有明显的降解(在10%以内)，16 h后直至7 d内，维生素B1衍生产物含量趋于稳定。数据分析结果表明，储存条件及时间对峰面积均无显著差异（P＞0.05）。标样与样品有相同的降解规律，考虑到标样与样品是同时衍生的，进样不可避免有时间差，为了减少误差，维生素B1衍生后，适合在第二天进行检测。

2.2 标准曲线、线性范围及检出限

配制维生素B1质量浓度为100 m g/L的标准溶液，分别稀释配成质量浓度为（0.05，0.1，0.2，0.5，1.0）m g/L的系列标准工作液，各取2.0 m L，按实验方法进行衍生处理，以所得峰面积对标准工作溶液的质量浓度进行回归分析，线性回归方程、线性相关系数见表2。按实验方法检测空白奶粉(5 g)中添加1.0μg维生素B1的样品，维生素B1的信噪比均大于3，因此把本方法的检出限定为0.2 mg/kg。我国目前检测维生素B1的方法中检出限为0.3 mg/kg，本实验方法满足婴幼儿配方奶粉中维生素B1的检测要求。线性回归方程式、线性相关系数和检出限（S/N=3）见表2。

表1 维生素B1衍生产物在不同储存条件、不同时间下的峰面积 (mAU·s)

表2 标准曲线及检出限

2.3 回收率和精密度试验

以空白奶粉样品为基体，添加维生素B1标准溶液，按上述方法及仪器条件进行回收率试验，每个添加水平作6次平行，添加水平、平均回收率及精密度见表3。

表3 回收率及精密度试验结果

由表3可知，空白奶粉中维生素B1含量检测，添加水平在0.5、1.0、5.0 m g/kg时，平均回收率为89.6%～97.7%，相对标准偏差为1.28%～3.64%，符合相关规定要求。

2.4 样品的测定

按方法1.3进行取样测定，并用GB 5009.84-2016规定的方法进行对照，由表4可知，本方法测定结果的准确度和精密度较为满意。

表4 奶粉中维生素B1含量测定结果

3 结论

本文建立了婴幼儿配方奶粉中维生素B1含量检测的方法，该方法能满足日常对婴幼儿配方奶粉中维生素B1含量检测的要求。同时对维生素B1衍生产物的稳定性进行了研究，GB 5009.84-2016对维生素B1衍生后要求在4 h内进样，但通过对3个不同阶段奶粉，在不同的储存条件下，在不同时间点进行检测的方法，结果表明维生素B1衍生后保存条件对其含量的影响没有显著差异，在16 h内有明显的降解(在10%以内)，16 h后直至7 d内，维生素B1衍生产物含量趋于稳定。