不同地区油茶内生真菌多样性及其抑菌活性

陈言柳，裴男才，吴 斐，张 扬，郭春兰，张林平*，李子林



不同地区油茶内生真菌多样性及其抑菌活性

陈言柳1，裴男才2，吴 斐1，张 扬1，郭春兰1，张林平1*，李子林3

（1. 江西农业大学 鄱阳湖流域森林生态系统保护与修复国家林业局重点实验室，江西 南昌 330045；2. 中国林业科学研究院 热带林业研究所，广东 广州 510520；3. 九连山国家级自然保护区管理局，江西 龙南 341702）

以江西、湖南、福建3个地区的油茶不同组织为材料，通过组织分离法分离其内生真菌并进行多样性分析和抑菌性分析。结果表明，共分离出352株内生真菌，隶属34属56种，其中子囊菌46种（86.65％），担子菌10种（13.35％）。球座菌属（）、拟茎点属（）、炭疽菌属（）以及链格孢属（）为优势属，分别占总株数的17.33%、16.19%、13.35%以及6.25%。从分离部位上看，叶片中的内生真菌分离率和定殖率最高，分别为71.11%和73.89%，而树皮中的内生真菌拥有最高的多样性指数；从采样地点上看，江西油茶内生真菌的分离率和定殖率最高，其次是湖南和福建。抑菌性结果显示，共有26种（46.43％）内生真菌具有抑菌活性，其中3株内生真菌（CF108，CF100，CF65）对所选的病原菌具有较强的抑制活性，表明这3株内生真菌具有较好的应用潜能。

油茶；内生真菌；多样性；抑菌活性

油茶（Abel）系常绿小乔木或灌木，是我国亚热带地区特有的木本食用油料树种[1]。油茶的工业价值、旅游文化价值、生态价值、食用价值等市场经济价值是不可估量的[2]。但是，随着油茶大面积种植和集约化生产的发展，加之油茶高产优良无性系推广，油茶病害的发生程度突显严重，成为当前我国油茶生产的主要矛盾，严重制约了油茶产业的可持续发展[3]。内生真菌是指一直生活在植物体内或其生活史的一定阶段处于植物体内并对寄主植物不形成明显病症的真菌[4]。大量研究发现，内生真菌能够与寄主植物形成共生关系，对宿主的生长有促进作用，并生产与寄主植物相同或相似的活性次生代谢产物[5-7]，有抗菌、抗肿瘤、杀虫、免疫抑制、抗氧化等生物活性[8-10]。

本课题组前期证实油茶中具有丰富的内生真菌资源，但未对内生真菌的应用潜能进行研究。因此，本研究以江西南昌、湖南长沙、福建罗源的油茶为材料进行内生真菌分离鉴定，探讨油茶内生真菌的地理差异与分布，并进行内生真菌抑菌活性筛选，为进一步开发利用油茶内生真菌资源提供理论依据。

1 材 料

1.1 供试样品

供试样品于2016年9月分别从江西南昌、湖南长沙和福建罗源三地随机选取3株新鲜健康的油茶植株（表1），采集其叶片、茎、树皮和果实，取样后迅速分装于无菌密封袋中密封保湿，并于4 ℃冰箱中保存备用。

表1 三个采集点的地理位置及特征

1.2 抑菌实验指示菌

本试验共选取了7种病原菌作为指示菌，其中4种病菌真菌，3种病原细菌。

病原真菌：胶孢炭疽菌（A）：辣椒疫霉病菌（B）：水稻纹枯病菌（C）：、茄枯萎病病菌（D）：。

病原细菌：大肠杆菌（E）：金黄色葡萄球菌（F）：、枯草芽孢杆菌（G）：。上述病原指示菌均保存于鄱阳湖流域森林生态系统保护与修复实验室（江西农业大学）。

2 方 法

2.1 油茶内生真菌的分离与纯化

取新鲜健康的油茶叶、茎、树皮和果实用清水洗净后进行表面消毒。植物组织块的表面消毒按下列步骤进行：将组织材料放入体积分数为75%乙醇中浸泡1 min，无菌水冲洗3~4次，紧接着用2.5%次氯酸钠溶液浸泡3 min，再用无菌水冲洗3~4次后放入干燥的无菌滤纸上。吸干后用无菌剪刀将叶、皮剪成5 mm×5 mm的小片、枝条切成5 mm长的小段、果剪成5 mm ×5 mm ×5 mm小块。上述组织块分别置于PDA平板中，每皿5块，设置3个重复，置于28 ℃恒温培养箱培养4~5 d，观察材料切口处菌丝有无及生长情况。为确保材料彻底消毒，以最后一次冲洗的无菌水作为对照。若对照组培养基未长出菌丝，说明表面消毒彻底。待切口处长出菌丝后，采用尖端菌丝挑取法转接至新鲜无菌的PDA培养基中纯化。纯化后再转接到PDA斜面试管中，置于4 ℃冰柜保存[11]。

2.2 内生真菌的鉴定

采用形态和分子相结合的方法对菌株进行鉴定，对产孢的菌株观察其孢子的大小、形状、颜色和产孢结构等形态特征，依据相关图鉴和文献进行鉴定[12]；对不产孢的菌株进行DNA提取，采用ITS序列分析进行鉴定[11]。

2.3 内生真菌抑菌活性测定

采用平板对峙法测定抑菌活性[13]。将供试病原菌和内生真菌分别接入PDA平板上活化培养5~7 d，在相同位置上用打孔器将其分别打成直径约5 mm的菌饼，再将病原菌及内生真菌菌饼接种于同一PDA平板上，2个菌饼相距5 cm。此外，将各病原菌菌饼分别单独接种于PDA平板上，作为空白对照，每组3个重复。25 ℃恒温培养7 d，观察病原菌生长状况及抑菌圈大小[14-16]。

2.4 数据分析

采用分离率（isolation rate，IR）、定殖率（colonization rate，CR）、相对频率（relative frequence，RF）以及多样性指数(biodiversity index, H’)来分析油茶内生真菌的多样性、优势菌群以及分布特性等[17]。计算方法如下：

分离率=内生真菌株数/组织块总数´100% （1）

定殖率=产菌组织块数/组织块总数´100% （2）

相对频率=某种菌的株数/菌株总数´100% （3）

Shannon-Weiner指数' =-∑i×lni（4）

Simpson多样性指数= 1-∑i2（5）

i=某种菌的株数/菌株总数 （6）

均匀度指数='/Ln() （7）

'为Shannon-Wiener指数；为物种数。

3 结果与分析

3.1 不同地区油茶内生真菌的组成

从3个省份采集油茶叶片、茎、树皮和果实的720个组织块中总共分离出352株内生真菌，隶属于34属56种。其中从树皮中分离出38种，果中23种，叶片中22种，茎中18种，只有4种内生真菌同时存在于油茶的各个组织中。油茶内生真菌的优势属为球座菌属（相对率，17.33%）、拟茎点属（相对频率，16.19%）、刺盘孢属（相对频率，13.35%）以及链格孢属（相对频率，6.25%）（表2）。

表2 油茶内生真菌的种类组成及相对频率

-#:从叶中分离; -&:从茎中分离;-*:从树皮中分离;-$:从果实中分离; MS:无孢菌类;ND:未确定;定殖率;RF：相对频率

3.2 不同地区油茶不同组织的内生真菌定殖率、分离率和多样性比较

油茶内生真菌菌群因采样地不同而有区别（表3）。从分离率上看，其中江西144株（59.17%）、湖南110株（45.00%）、福建98株（39.58%）。从定殖率上看，江西（60.00%）>湖南（54.58%）>福建（40.41%）。油茶内生真菌总的Shannon-Weiner指数(')为3.37，而3个地区的油茶内生真菌Simposon多样性指数和Shannon-Weiner多样性指数分别介于0.727 3~0.921 6和1.540 3~2.876 9。其中江西的油茶内生真菌多样性指数最高，Simpson多样性指数()和Shannon-Weiner指数(')分别为0.696 3和1.274 9；福建的最低，和'分别为0.692 8和1.265 7。三地油茶内生真菌的Margalef丰富度指数分别为18.61，13.18和14.53，表明江西的油茶内生真菌比湖南、福建的更为丰富。

油茶不同组织部位的定殖率和分离率差异也较大（表3）。油茶内生真菌总分离率和总定殖率均为58.67％，不同组织部位内生真菌的分离率和定殖率范围在0.27~0.92。叶片（71.11%，73.89%）中最高，依次是树皮（67.22%，68.33%）>果实（30.00%，30.00%）>茎（23.33%，23.33%）。从叶片中分离出116株内生真菌，占总数的32.95％；其中胶孢炭疽菌（），芒果球座菌（），桔青霉菌（）为优势种。此外，在油茶组织内发现了内生真菌特有种，其中4种仅在叶中发现，茎和果实中都发现了8种特有内生真菌。虫状球座菌（）仅分布于树皮内，且为优势种。

表3 不同地区油茶不同组织的内生真菌分离率和多样性比较

3.3 油茶内生真菌的抑菌能力

以7种植物病原菌为指示菌，包括4种病原真菌和3种病原细菌，测定56种油茶内生真菌的抑菌活性。结果表明，56株油茶内生真菌中有26株（46.43％）对指示病原菌具有抑制作用（表4）。其中有21株对所有病原真菌产生了抑菌作用，8株对所有病原细菌产生了抑菌作用。23株抗胶孢炭疽菌（），25株抗辣椒疫霉病菌（），23株抗水稻纹枯病菌（），26株抗茄枯萎病病菌（），18株大肠杆菌（），15株抗金黄色葡萄球菌（），14株抗枯草芽孢杆菌（）。此外，有8株（8/26）对所有的病原菌都表现出了抗菌活性，其中CF108的抑菌作用最强。有6株可以同时抑制6种病原菌，8株能够同时抑制5种病原菌，3株能够同时抑制4种病原菌，1种菌株能够同时抑制3种病原菌。而有3种内生真菌CF108，CF100，CF65能够较明显地抑制所有的病原菌。

表4 油茶内生真菌培养物的抑菌活性

“+”抑菌活性（弱），“++”抑菌活性（中），“+++”抑菌活性（强）；“-”无抑菌活性

A:；B:；C:；D:；E:；F:；G:

4 结论与讨论

植物内生真菌是一类纯天然的活性物质，有着独特且重要的应用价值，其种类、分布以及定殖因植物种类不同而异，且大多数属于子囊菌[18-19]。本试验主要采用组织培养分离法，从江西、湖南、福建3个省份油茶的树皮、茎、叶和果实共720个组织块中分离出352株内生真菌，经形态学和分子学鉴定为34属56种。其中球座菌属（）、拟茎点属（）、刺盘孢属（）以及链格孢属（）为优势属，这些菌属也存在于其他人的研究中[20-21]。

不同部位的内生真菌定殖率不同，叶片的内生真菌定殖率最高（71.11%），而茎的内生真菌定殖率最低（23.33%）；内生真菌分离率的变化规律与定殖率一致，最高的也是叶片（73.89%），最低为茎（23.33%），这与张林平等[22]研究结果相同。不同地区间油茶内生真菌的分离率和定殖率不同，江西（59.17%，60.00%）>湖南（45.00%，54.58%）>福建（39.58%，40.41%），这可能是因为江西气候宜人，湿度大的特点，利于油茶内生真菌的生长和定殖。由此可见，分离出的内生真菌的种类和数量受到取样部位和取样地点的影响。

内生真菌具有抑菌性是由于其能够产生抑菌性的物质[23-24]。本研究发现油茶中存在26株能够抑制病原菌的内生真菌。其中3株内生真菌CF108，CF100，CF65具有抑菌广谱性，能够抑菌7种病原菌。经分子鉴定，CF108属于楔孢菌属（）、CF100和CF65属于青霉属（）。近年来，大量研究表明青霉菌属（）能够产生活性物质且具有较好的抑菌和抗肿瘤的作用，如张志娟[25]以spTS67菌株为试验材料，对其粗蛋白的生物活性进行了研究；郑彩娟等[26]对红树尖瓣海莲内生真菌spJ41221进行代谢产物及其抗菌活性研究；叶科元[27]从南极海参体内分离出菌株spS-1-16，对其次生产物的结构及其生物活性进行了研究，发现该菌株具有较好抑制肿瘤的作用。然而，目前对于楔孢菌属（）的研究甚少，课题组下一步将对其活性成分进行研究，确定其抑菌成分，为开发更多油茶新型高效抑菌剂的研制提供理论基础和科学依据。

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Diversity and Antibacterial Activity of Endophytic Fungi fromin Different Regions

CHEN Yan-liu1, PEI Nan-cai2, WU Fei1, ZHANG Yang1, GUO Chun-lan1, ZHANG Lin-ping1*, LI Zi-lin3

(1. Key Laboratory of State Forestry Administration on Forest Ecosystem Protection and Restoration of Poyang Lake Watershed (JAU), Nanchang 330045, China; 2. Research Institute of Tropical Forestry, Chinese Academy of Forestry, Guangzhou 510520, China; 3. Jiulian Mountain National Nature Reserve Administration, Longnan, Jiangxi 341702, China)

To explore the distribution and diversity of endophytic fungi in, strains with antibacterial activity were screened.The different tissues ofin Jiangxi, Hunan and Fujian were used as materials to separate endophytic fungi by tissue separation and to analyze the diversity and antimicrobial activity. The results showed that 352 endophytic fungi were isolated, belonging to 56 species of 34 genera, including 46 species (86.65%) of ascomycetes and 10 species (13.35%) of basidiomycetes. The genus,,andwere dominant genus, accounting for 17.33%, 16.19%, 13.35% and 6.25% of the total, respectively. From the separation position, the endophytic fungi had the highest separation rate and colonization rate of 71.11% and 73.89%, respectively, while the endophytic fungi in the bark had the highest diversity index. From the sampling point, the isolation and colonization rate of endophytic fungi offrom Jiangxi were the highest, followed by Hunan and Fujian. The antimicrobial assay showed that a total of 26 (46.43%) endophytic fungi had antibacterial activity, and 3 endophytic fungi（CF108，CF100，CF65） had obvious inhibitory effects on all pathogenic bacteria, indicating that these three endophytic fungi had a good application potential.

; endophytic fungi; diversity; antibacterial activity

S794.4

A

2095-3704（2018）04-0261-07

2018-09-29

国家自然科学基金项目（31660189、31570594）、江西省科技计划项目（20161BAB204187）和江西省教育厅项目（GJJ150414）

陈言柳（1995—），男，硕士生，主要从事森林保护学研究，xiaoliuchen0316@126.com；

张林平，副教授，博士，zlping619@163.com。

10.3969/j.issn.2095-3704.2018.04.56

陈言柳, 裴男才, 吴斐, 等. 不同地区油茶内生真菌多样性及其抑菌活性[J]. 生物灾害科学, 2018, 41(4): 261-267.