高血压大鼠脑白质病变中髓鞘和轴索改变☆

邱宝山 蔡颖 廖梦诗 林晶 范玉华○☆

脑白质病变是脑小血管病的一种重要类型，临床表现无特异性，通常表现为认知障碍、痴呆及自主神经功能紊乱等，临床诊断主要依据影像学上T2WI及FLAIR像侧脑室旁及深部白质高信号[1-4]。脑白质病变的发病机制尚不明确，可能与血脑屏障破坏、氧化应激、内皮细胞-周细胞功能失调、脑血流自动调节等因素有关，目前临床无有效治疗方法[5-8]。有髓神经纤维由轴索和髓鞘组成，为研究轴索微结构，轴索又可分为郎飞结、结侧区、近结侧区和结间区4个区域，接触蛋白相关蛋白（contactin-associated protein,Caspr）是结侧区轴膜的特异性蛋白，正常的轴索微结构是有髓神经纤维跳跃式传导的基础[9]。目前脑白质病变典型病理改变是髓鞘缺失[10]，但对于白质纤维轴索微结构病理改变的研究甚少，为此，我们通过建立易卒中型肾血管性高血压大鼠-双侧颈总动脉夹闭模型（stroke-prone renovascular hypertensive rats-2 vessel occlusion,RHRSP-2VO），观察脑白质病变中轴索微结构的变化，为临床诊断与治疗提供新策略。

1 材料与方法

1.1实验动物与分组18只4周龄健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（广东省实验动物中心），体质量约70 g～90 g。所有大鼠均饲养于中山大学北校区实验动物中心（SPF级环境），随机分为假手术组（n=9）和手术组（n=9），实验过程全部遵循科技部《关于善待实验动物的指导性意见》。

1.2易卒中型高血压大鼠慢性全脑低灌注模型的建立 手术组按照双肾双夹术构建RHRSP动物模型[10]，3个月后取收缩压≥180 mmHg的大鼠按照颈总动脉夹闭的方法行右侧颈总动脉夹闭术，24 h后以同样方法行左侧颈总动脉夹闭术。假手术组仅暴露双侧肾动脉和双侧颈总动脉，其余操作与手术组一致。

1.3 Morris水迷宫实验双侧颈总动脉夹闭后12周进行Morris水迷宫实验，实验流程参照既往研究中的步骤进行[11]，实验前1 d让大鼠在池中自行游泳180 s以适应水温和环境，第1～5天为定位航行试验（III象限中间放置平台，大鼠按4个象限入水点顺序放入水池，每只大鼠入水顺序相同，入水开始至登入平台为逃避潜伏期，如果60 s未找到平台则引导其登上平台，此时记录为（60 S），以每天4个入水点的逃逸潜伏期均数记录为每天的逃逸潜伏期；第6天为空间搜索试验，撤掉平台，记录60 s穿越平台次数。

1.4脑组织取材与病理学水迷宫实验结束后，对所有大鼠行灌注取脑；用4%多聚甲醛经心脏灌注后取出大脑，于4%多聚甲醛浸泡24 h，于嗅球后方1.5 mm处取4 mm厚脑组织，包埋后制成冠状面连续石蜡切片（3 μm）。 Hematoxylin-eosin（HE）染色、Luxol fast blue（LFB）染色、免疫组织化学染色和免疫荧光染色方法步骤参照既往研究进行[10]，免疫染色中所用抗体和浓度分别为小鼠抗大鼠MBP（1∶500，Abcam）、兔抗大鼠 Olig2（1∶200，Gene Tex）、兔抗大鼠 Caspr（1∶300，Abcam）、抗兔和抗小鼠荧光二抗（1:500，CST）。

1.5统计学方法采用Graphpad Prism 7进行统计学分析，计量数据以x±s表示。水迷宫逃逸潜伏期使用重复测量设计方差分析，其余数据满足正态分布及方差齐性情况下组间比较使用t检验。，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1死亡率假手术组9只大鼠全部存活，RHRSP/2VO组9只大鼠收缩压均达180 mmHg以上，3只大鼠在双侧颈总动脉夹闭后1 d死亡，其余6只RHRSP/2VO组大鼠存活。

图1 水迷宫结果逃逸潜伏期和穿越平台次数。A为定位航行试验逃避潜伏期；B为空间探索试验穿越平台次数；*表示与假手术组相比，P＜0.05

2.2 Morris水迷宫实验结果定位航行实验表明在双侧颈总动脉夹闭术后第12周手术组与假手术组逃逸潜伏期均逐渐下降，第1、2天手术组和假手术组逃逸潜伏期无统计学差异，第3～5天手术组和假手术组逃逸潜伏期有统计学差异（P＜0.05）；第6天手术组穿越平台次数（2.33±0.76,n=6）较假手术组（5.56±0.63,n=9）减少，有统计学意义（P＜0.05）。

2.3 HE染色手术组在双侧颈总动脉夹闭术后第12周后观察到脑内高血压性小动脉硬化、玻璃样变；假手术组小动脉无内膜增厚、无管腔狭窄。

2.4 LFB染色手术组在双侧颈总动脉夹闭术后第12周后观察到侧脑室旁双侧胼胝体出现髓鞘条索状脱失紊乱、形成空泡；假手术组在同一时间点同一部位的胼胝体纤维排列紧密有序。

图2 病变部位 HE、LFB、MBP免疫组化结果（400×）。图A为手术组大脑切片HE染色图，黑色箭指小动脉硬化、内膜增厚、玻璃样变；图B为假手术组大脑切片HE染色，白色箭指正常的小动脉。图C为手术组胼胝体出现条索状、空泡状脱髓鞘改变（黑色箭）；图D为假手术组胼胝体髓鞘紧密排列，无脱失。图E为手术组胼胝体出现条索状、空泡状脱髓鞘改变（黑色箭）；图F为假手术组胼胝体染色均匀。Bar=50μm

图3 少突胶质细胞免疫荧光染色（200×）。对比假手术组，手术组胼胝体病变部位少突胶质细胞明显减少。Bar=100 μm

图4 Caspr免疫荧光染色 （1000×）图A是手术组脑白质病变部位；图B是假手术组对应部位；图C、D、E是手术组脑白质病变病灶周围髓鞘正常区域；图F是两组郎飞结长度统计图；图C中放大区域可见郎飞结长度增加。Caspr代表郎飞结结侧区，相邻结侧区之间的间隙为郎飞结长度；白色星号指直径增粗的结侧区,白色箭头指病态延长的结侧区；*表示与假手术组相比，P＜0.05。Bar=10 μm

2.5 MBP免疫组化染色手术组免疫组化染色出现胼胝体纤维紊乱，出现空泡；假手术组胼胝体染色均匀。纤维排列紧密。

2.6免疫荧光染色少突胶质细胞免疫荧光染色显示：相对假手术组，手术组颈总动脉夹闭术后第12周胼胝体病变区域少突胶质细胞减少；结侧区特异性蛋白-Caspr免疫荧光染色显示：手术组术后第12周胼胝体白质纤维轴索结侧区缺失，对照组假手术后第12周相应部位结侧区规则排列；手术组术后第12周胼胝体脱髓鞘部位的周围髓鞘正常的白质区域纤维轴索郎飞结长度增加 （P＜0.05）、结侧区直径增粗、长度延长。

3 讨论

本研究发现正常脑白质富含排列规则的Caspr,而RHRSP-2VO模型除了具有典型的脑白质脱髓鞘及小动脉硬化的病理改变，还存在病变区域Caspr表达明显减少，病变周围髓鞘正常区域郎飞结和结侧区长度增加、结侧区增粗的异常病理改变，说明脑白质病变是髓鞘和轴索共同损伤的过程。

郎飞结两侧的结侧区是轴索与少突胶质细胞相互作用的关键部位，主要通过三种黏附分子（轴索上的接触蛋白、Caspr、胶质细胞神经束蛋白-155）相互作用形成复合体，该区域对Na+、K+的高度聚集和分隔起重要作用[9,12-13]。本研究发现病变部位Caspr表达减少并且排列紊乱，说明慢性脑白质病变不仅仅是单纯的髓鞘丢失，还存在轴索结侧区结构和功能的破坏。结侧区作为轴索重要组成部分，从功能上说，一方面，结侧区是少突胶质细胞髓鞘成环包绕轴索的关键部位，该部位Caspr的缺失将影响轴索和少突胶质细胞的相互作用从而导致髓鞘不能形成[14-15]，这可能与少突胶质细胞功能紊乱及数量减少有关；另一方面，结侧区作为屏障分隔郎飞结区的Na+通道和近结侧区的K+通道[9]，结侧区的缺失间接破坏了Na+的高度聚集状态，阻碍了局部电位形成，继而降低有髓神经纤维跳跃式传导效率。因此，髓鞘丢失和结侧区结构异常是脑白质病变的重要病理基础，共同降低了中枢神经系统有髓神经纤维的传导效率，继而影响了认知功能。

郎飞结是有髓神经纤维的重要结构，含有高度聚集的Na+通道[16]，本研究中病变周围尚未脱髓鞘部位出现的郎飞结的病态伸长，降低了Na+的平均密度，直接破坏了郎飞结处Na+高度聚集状态，继而降低了郎飞结跳跃式传导的效率。从另一个角度来说，这些髓鞘正常部位的轴索损伤可能早于髓鞘脱失，那么轴索损伤是否在整个脑白质病变之前就已经出现，这种预测价值需要更多的实验来探究。同时，本研究还发现病变周围未脱髓鞘部位的结侧区异常增粗与病态伸长，许多关于多发性硬化的研究表明，结侧区的增粗和延长是髓鞘脱失的预测信号[17]，那么在RHRSP-2VO模型中，结侧区的结构异常是否是脑白质慢性脱髓鞘的预测信号，其中的机制需要在疾病发生早期进一步研究。脑白质病变患者临床表现无特异性，而且患者的临床症状往往与其影像学显示的病变性质和严重程度不一致[18]，单从局部病变区域的脱髓鞘改变无法合理解释严重的临床症状，这可能是由于目前无法从常规影像学观察到脱髓鞘病灶周围潜在的轴索损伤，另外这些轴索微结构损伤可能扩散到周边或远隔脑区，扰乱脑网络的连接，影响全脑的有效通信继而引起认知减退、步态异常和自主神经功能紊乱等表现[19]。本实验的不足之处在于未能在更多的时间点和用多个不同指标全面评价轴索病理改变，轴索损伤及与脑白质病变的先后关系与机制需要进一步研究。

总而言之，慢性脑白质病变不仅有髓鞘丢失，同时还存在轴索损伤。轴索损伤可能是脑白质病变的潜在机制，轴索损伤的修复将是临床脑白质病变治疗的新领域。