非小细胞肺癌患者EGFR突变率及与临床病理关系和TKI靶向治疗效果

张海涛 王 春 张映铭 王彩英 方申存 吴 静 许 斌 刘 丹

肺癌为临床常见恶性肿瘤，该病发病率及病死率在近年来呈上升趋势，严重威胁人类健康及生命安全，其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)为常见类型，占所有肺癌80%，该类型肺癌生长分裂及扩散转移较慢，虽然其治疗技术在不断改进，但放化疗疗效多不理想，预后较差[1-2]。表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)信号通路为NSCLC形成及发展过程中至关重要的通路，其EGFR为蛋白老氨酸激酶受体，可抑制肿瘤细胞死亡，促进肿瘤细胞增殖、肿瘤血管生成与转移，因此分析该基因突变与NSCLC患者临床病理特征的关系对指导疾病治疗有重要意义[3-6]。靶向药物治疗在NSCLC中的疗效已获得国内外肿瘤专家认可，其疗效与肺癌细胞EGFR基因第19及21外显子突变状态关系密切，其中酪氨酸酶抑制剂(tyrosinase inhibitor ，TKI)靶向治疗所用的主要药物吉非替尼、厄洛替尼是EGFR抑制剂，对EGFR基因突变患者疗效较好，且不良反应轻[7-9]。本文选取2014年5月至2016年8月我院收治的NSCLC患者100例为研究对象，分析其EGFR突变率与临床病理关系和TKI靶向治疗效果，现报道如下。

资料与方法

一、一般资料

选取2014年5月至2016年8月我院收治的晚期NSCLC患者100例为研究对象，均符合《中国表皮生长因子受体基因突变和间变淋巴瘤激酶融合基因阳性非小细胞肺癌诊断治疗指南(2013版)》中NSCLC诊断标准，纳入标准：①入院时卡氏评分(KPS)>60分，美国东部肿瘤协作组活动状态评分0或1分，且具有细胞病理学诊断证据，肿瘤分期Ⅲ-Ⅳ期；②血液学、生化检查评价器官功能正常，肿瘤直径不超过 5 cm；③治疗前均已放弃放化疗治疗，并签署知情同意书[10]。排除标准：①近期使用其他治疗或既往应用过铂类联合紫杉醇类方案化疗；②不可控制且有症状的脑转移，活动状态评分>1分或其他原因无法耐受TKI化疗者；③CT检查发现癌细胞发生远处转移，活体检测发现远处淋巴结有转移现象。

二、研究方法

1. EGFR突变率检测： 用无菌刀片刮取5～10张8 μm厚的连续石蜡切片中癌组织区域，保证肿瘤细胞含量在30%以上，石蜡组织脱蜡后以DNeasy 组织试剂盒(Qiagen，德国)自肿瘤组织中提取DNA，应用NanoDrop 2000分光光度计(Thermo Scientific，美国)测定DNA浓度，所有DNA吸光度值A260/280均在1.8～2.0，用无水DNase水稀释至100 ng/μl备用。采用人类EGFR基因突变检测试剂盒(厦门艾德生物医药科技有限公司，中国)应用荧光聚合酶链反应(PCR)，依据试剂盒说明书操作，测定EGFR第18-21号外显子的最常见29种体细胞突变情况。PCR引物：EGFR基因第18号外显子上游引物：5’-GCTGAGGTGACCCTTGTCTC-3’(20bp)，下游引物：5’-CTCCCCACCAGACCATGA-3’(18bp)；第19号外显子上游引物：5’-CATGTGGCACCATCTCACA-3’(19bp)，下游引物：5’-CAGCTGCCAGACATGAGAA-3’(19bp)；第20号外显子上游引物：5’-CATGCGTCTTCACCTGGAA-3’(20bp)，下游引物： 5’-AGCAGGTACTGGGAGCCAA T-3’(19bp)；第21号外显子上游引物：5’-CCTCACAGCAGGGTCTTCTC-3’(20bp)，下游引物：5’-TGCCTCCTTCTGCATGGTA-3’(19bp)，测序产物经NaAc与乙醇纯化后，在ABI 3500XL基因分析仪上进行双向测序，测定结果采用相关软件进行分析。EGFR突变阳性判断标准：循环阈值(Ct)<26；②26≤Ct<29，且ΔCt值(突变Ct-外控Ct)≤11(19-del突变、L858R突变)或ΔCt值≤7(G719X突变)或ΔCt值≤8(S7681突变、L861Q突变)。

2. TKI靶向治疗方法： 选择口服靶向药物，服用吉非替尼片(易瑞沙，国药准字J20100014，分装企业：阿斯利康制药有限公司，规格：0.25 g/片)1片/次，1次/d，口服，空腹或与食物同服。盐酸厄洛替尼片(特罗凯，国药准字J20120059，分装企业：上海罗氏制药有限公司，规格：150 mg/片)1片/次，1次/d，口服，在进食1 h或进食后2 h服用。或盐酸埃克替尼片(凯美纳，国药准字H20110061，生产单位：浙江贝达药业有限公司，规格：125 mg)，1片/次，3次/d。口服，在进食前1 h或进食后2 h服用，直至出现疾病进展。服药最短1个月，最长13个月，治疗后随访2年，口服靶向药物期间不接受化疗等其他抗肿瘤治疗，并定期至我院复查CT评价疗效。

三、观察指标

(1)对EGFR突变与临床病理的关系进行单因素与多因素Logistic分析；(2)分析NSCLC患者EGFR基因突变特点；(2)比较EGFR突变型与野生型采用TKI靶向治疗的疗效：近期(1年内)疗效诊断标准参照实体肿瘤疗效评价标准1.1版，分为完全缓解(complete remission, CR)、部分缓解(partial remission, PR)、疾病稳定(stable diseasse, SD)、疾病进展(progressive disease, PD)，达CR及PR的患者4周后再确认疗效，有效率=(CR+PR)/总例数×100%；(4)应用Kaplan-Meier法分析患者1年、2年生存率，并绘制生存曲线。

四、统计学方法

结 果

一、100例NSCLC患者EGFR突变与临床病理的单因素分析

100例NSCLC患者中，共44例发生EGFR突变，EGFR突变率为44.00%。单因素分析结果显示EGFR突变率大小为：女性高于男性，吸烟患者高于不吸烟患者，腺癌高于非腺癌，差异对比均有统计学意义(P<0.05)，不同年龄、肿瘤分期患者EGFR突变率对比差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 100例NSCLC患者EGFR突变与临床病理的单因素分析[n(%)]

二、100例NSCLC患者EGFR突变与临床病理的多因素分析

多因素Logistic回归分析结果显示性别为女性、病理类型为腺癌是导致NSCLC患者EGFR发生基因突变的独立危险因素(P<0.05)，见表2。

表2 100例NSCLC患者EGFR突变与临床病理的多因素分析

三、NSCLC患者EGFR基因突变特点分析

EGFR基因突变检测发现发生EGFR突变的基因共44例，共检测到EGFR突变基因44个，主要类型包括18号外显子点突变2个(4.54%)、19号外显子缺失突变19个(43.19%)、20号外显子插入突变及点突变5个(11.36%)、21号外显子点突变18个(40.91%)，未发现两种外显子同时突变，4种外显子中以19号和21号外显子的突变多见，占总突变的84.09%(37/44)。

四、EGFR突变型与野生型采用TKI靶向治疗的疗效

正常组织没有EGFR基因突变，均为野生型，本研究中突变型44例，野生型56例。疗效分析显示TKI靶向治疗对EGFR突变型NSCLC患者的近期(1年内)有效率明显高于野生型(P<0.05)，见表3。

表3 EGFR突变型与野生型采用TKI靶向治疗的疗效[n(%)]

注：CR：完全缓解；PR：部分缓解；SD：病情稳定；PD：疾病进展

五、NSCLC患者采用TKI靶向治疗后1年、2年生存率分析

100例患者中，2年内获随访98例，失访1例，随访时间为3.0～29.1个月，中位生存时间23.6个月，EGFR基因突变型患者1年、2年生存率与野生型对比差异无统计学意义(P>0.05)，见表4、图1。

表4 NSCLC患者采用TKI靶向治疗后1年、2年生存率分析

图1 EGFR基因突变与EGFR野生患者的生存曲线分析

讨 论

肺癌是世界范围内常见恶性肿瘤，该病在中国发病率及病死率均居肿瘤首位，5年生存率低，其中NSCLC约占所有肺癌患者80%，且该病早期不易察觉或症状不明显，大多数在就诊时已达中晚期甚至伴远处转移[11-12]。因此探讨其治疗方案及发病特点有重要临床意义[13-14]。EGFR为一种跨膜蛋白，定位在细胞膜上，先以单体形式存在，当单体与配体结合后，两个带有配体的EGFR单体就会相互结合，形成有激酶活性的二聚体，在EGFR形成二聚体后，二聚体的磷酸激酶活性会发挥作用，肿瘤细胞中存在EGFR信号传导通路，当EGFR过度表达或发生突变等异常，会促进细胞不断增殖并抑制其凋亡，导致生长调节失控[15-18]。研究表明NSCLC患者EGFR突变与其性别吸烟、病理类型有关，女性患者的EGFR突变率显著高于男性，在明确有吸烟史患者中，有吸烟史患者EGFR基因突变率明显高于无吸烟史患者，且EGFR在肺腺癌中突变率高于非腺癌者，因此认为NSCLC患者发生EGFR基因突变与其临床病理关系密切[19-22]。晚期NSCLC的常用治疗方法包括化疗、放疗、靶向治疗，以往常采用以铂类为基础的化疗方案，近年来各种分子靶向药物(如TKI)的出现，使EGFR突变阳性患者中位总生存期>2年，且这种治疗针对性强、有效率高、缓解期长、毒副作用小，TKI(如吉非替尼、厄洛替尼、埃克替尼等)是肺癌靶向治疗常用药物[23]，其疗效及敏感性与EGFR基因突变状态有关，研究发现EGGR基因位于人类第7号染色体短臂上，目前证实的有临床意义突变点集中于第18-21号外显子上，最多见的为19号外显子缺失和21号外显子点突变，约占突变总数的86%，19号外显子缺失由于突变位点及缺失碱基长度不同而使得突变类型较多，这些位点的突变改变了EGFR胞内ATP结合区结构，提高了EGFR对TKI药物的结合能力[24-25]。

在NSCLC患者EGFR突变率与临床病理的关系方面，姚晓燕等[26]研究显示，女性EGFR突变率高于男性，吸烟患者突变率较不吸烟患者高，且腺癌突变率明显高于非腺癌患者，而多因素分析结果显示女性、腺癌是EGFR突变的独立危险因素，而吸烟史为非独立相关因素，本研究结果显示对于NSCLC患者，其EGFR突变率为：女性>男性，吸烟患者>不吸烟患者，腺癌患者>非腺癌患者，而不同年龄、肿瘤分期患者EGFR突变率比较差异无统计学意义。此外多因素Logistic回归分析结果显示性别为女性、病理类型为腺癌是引起EGFR发生基因突变的独立危险因素，这与上述研究结果相近。因此NSCLC患者EGFR基因突变与病理关系密切，尤其是性别、病理类型为影响EGFR突变的独立危险因素，但也需重视对吸烟患者及不同年龄患者的EGFR突变检测[27-28]。在EGFR基因突变特点方面，凌云等[29]在探讨非小细胞肺癌中EGFR和KRAS基因突变的特点及与临床病理特征的关系时发现，EGFR突变类型主要包括18外显子点突变4.0%、19号外显子缺失突变44.5%、20号外显子插入突变与点突变9.7%、21号外显子点突变41.4%，以19号、21号外显子为主，共占85.9%，本文结果显示100例患者中共检测到EGFR突变基因44个，分别为18号外显子点突变4.54%、19号外显子缺失突变43.19%、20号外显子插入突变及点突变11.36%、21号外显子点突变40.91%，且外显子中以19号和21号外显子的突变多见，占总突变的84.09%，这与上述研究结果相近。因此，EGFR的突变位点主要集中在18-21号外显子，尤其以19号外显子缺失和21号外显子点突变多见。在治疗有效率及生存率方面，冯卫能等[30]研究显示肿瘤组织EGFR突变型与野生型患者EGFR-TKI治疗有效率分别为69%、11.1%，两者对比差异有统计学意义，仇晓军等[31]在分析非小细胞肺癌58例表皮生长因子受体突变状态时发现，EGFR突变型与野生型患者1年、2年生存率差异无统计学意义。本文显示EGFR突变型患者采用TKI治疗后，1年内治疗有效率68.18%显著高于野生型10.71%，这与上述研究结果相近。因此对于EGFR突变型患者，采用TKI靶向治疗可能在近期内从中获益，而对于野生型患者基本无效，两者在1年内、2年内生存率对比无明显差异，这可能与EGFR突变位点集中在18-21号外显子有关。18-21号外显子的突变改变NSCLC患者EGFR胞内ATP结合区结构，提高了EGFR对TKI药物的结合能力，因而疗效得以提高，虽然尚未发现EGFR突变型患者在1年、2年生存率方面获益，但从2年的生存曲线上可看出两条曲线有分开趋势，随随访时间延长，将会有更多患者采用TKI治疗，将可能从生存上获益，同时本文也建议在采用TKI靶向治疗前，对患者进行EGFR突变检测，综合考虑是否选择TKI治疗方案。

综上所述，NSCLC患者EGFR突变与其性别、病理类型关系密切，采用TKI靶向治疗EGFR突变型患者近期疗效优于野生型，远期生存是否获益可进一步开展研究。