低氧预处理人胎盘绒毛膜间充质干细胞环状RNAs的生物信息学分析

郝文革 孙逊沙 吴洁莹 陈劲松 喻秋霞 李 焱 吴韶清

1 广州医科大学附属广州市妇女儿童医疗中心(广州 510623) 2 中山大学附属广州市妇女儿童医疗中心(广州 510623) 3 中山大学附属第一医院(广州 510080)

间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)为普遍存在于人体各组织中的成体干细胞，具有自我更新、多向分化潜能、免疫抑制和易于转染的特性，是再生医学的理想种子细胞和基因治疗载体[1-2]。MSCs作为第二种用于临床治疗的成体干细胞，已有多种间充质干细胞药物用于临床疾病的治疗，而更多的临床前和临床研究正在进行。目前，在Clinicaltrials上登记的临床试验864项。临床和临床前研究主要使用骨髓源间充质干细胞。同骨髓源间充质干细胞比较，人胎盘源间充质干细胞易于分离提取，胎盘体积大，没有伦理障碍，而且因胎盘绒毛膜来源间充质干细胞扩增潜能更好而成为一种理想的间充质干细胞来源[3-5]。

已有研究表明，间充质干细胞的生物学特性受分离培养过程中多种因素的影响。其中，低氧预处理对间充质干细胞的细胞周期、增殖、凋亡、迁移和分化都有一定的影响[6-7]。但是其分子机制有待进一步研究。环状RNAs涉及到多种细胞的生物学特性，但是其在低氧预处理间充质干细胞中的分子机制未见报道。因此，我们在鉴定出低氧预处理人胎盘绒毛膜间充质干细胞环状RNAs的基础上[8]，用生物信息学手段分析预测环状RNAs的结合miRNA及其靶基因，并对预测的靶基因进行GO分析和pathway富集分析；同时，根据pathway相互作用分析出核心pathway，为进一步实验研究提供指引和理论依据。

1 材料与方法

1.1 circRNAs-miRNAs相互作用的生物信息学预测和网络构建

用基于TargetScan & miRanda的Arraystar公司的miRNA预测商业软件进行circRNA和microRNA相互作用预测[9]，为每个circRNAs预测5个相互作用的miRNAs。用Cytoscape软件绘制circRNAs-miRNAs可视网络图。

1.2 靶基因的生物信息学预测和网络分析

分别用targetScan7.1和mirdbV5数据库预测circRNAs高配备miRNAs的靶基因，在两个数据库中都预测存在的靶基因为真实可用的靶基因，并把靶基因分别在网站http://www.geneontology.org和http://www.genome.ad.jp/kegg上进行GO(Gene Ontology)功能富集分析和信号通路富集分析(KEGG pathway)。进行GO功能富集分析时采用Fisher精确检验法，算出P值后，通过多重比较，确定功能富集的假阳性率，然后只保留FDR≤0.1的数据，完成显著性功能富集。信号通路富集分析是对靶基因参与的所有信号通路进行的显著性分析，所用方法与GO功能富集分析相同。用Cytoscape软件构建circRNAs-miRNAs-mRNA可视网络图。

1.3 网络通路相互作用分析

在靶基因信号通路富集分析基础上，根据信号通路涉及的靶基因数目和信号通路富集分析中的FDR值，用Cytoscape软件构建信号通路之间相互作用网络图，分析信号通路之间的相关关系。

2 结 果

2.1 低氧预处理人胎盘绒毛膜间充质干细胞circRNAs对应的miRNAs预测和网络构建

按照碱基配备原则(图1)，用Arraystar公司商业软件为每个circRNAs配备了5个高配值的miRNAs。用Cytoscape软件构建circRNAs-miRNAs网络图(见图2)。

图1 circRNAs和对应miRNAs配备图

图2 circRNA-miRNA网络图

2.2 miRNAs靶基因的GO功能富集分析和网络构建

对预测的靶基因进行GO功能富集分析，检测靶基因的功能。在GO分析的生物过程中，富集程度最高的GO terms 为“Developmental process”和“Nervous system development”, 其他的包括“Multicellular organism development”, “Cellular developmental process” 和“Positive regulation of cellular process”等为细胞生物过程相关的功能(表1)。提示这些生物学过程可能参与了低氧预处理人胎盘绒毛膜间充质干细胞的生理过程。

表1circRNAs对应miRNA预测靶基因的GO生物学过程有差异的富集条目

2.3 靶基因的信号通路富集分析

用KEGG分析显示富集4个有意义的信号通路分析(P<0.05 且 FDR<0.05) (表2),分别为“Transcriptional misregulation in cancer”、 “mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathway”、“Adrenergic signaling in cardiomyocytes”和“Ubiquitin mediated proteolysis”。

2.4 网络通路相互作用分析

根据信号通路涉及的靶基因数目和信号通路富集分析中的FDR值，用Cytoscape软件构建信号通路之间相互作用网络图，构建通路相互作用网络图显示MAPK通路为核心信号通路(见图3)。

表2circRNAs对应miRNA靶基因的KEGG信号通路有差异的富集条目

图3 信号通路相互作用网络图

3 讨 论

氧对于几乎所有的生命都是必需的，它维持细胞的能量代谢及功能。氧张力对细胞生物学行为的影响在一系列的影响因素中最为突出，且通过控制氧张力来影响细胞的生物学行为简单易行[10]。20世纪90年代低氧诱导因子的发现使人们对低氧对机体的影响有了新的认识[11]。低氧对MSCs的生物学特性的影响及其在再生医学中的应用是不可忽视的[6-7]。已有研究表明，低氧对MSCs的细胞周期、凋亡、迁移、增殖和分化均有影响。在氧体积分数小于5%时，低氧预处理可以作为在一定程度上克服MSCs的增殖缓慢、移植后迁移率低、基因不稳定等细胞治疗缺陷的有效手段，可以提高其临床应用的有效性及安全性，对再生医学的研究有至关重要的意义[12-13]。

竞争性内源RNAs(pseudogene transcripts, lncRNAs, and circRNAs) 通过竞争结合miRNA反应元件调控基因表达的研究为生物医学的热点之一[14]。circRNAs的研究主要集中在肿瘤领域，circRNAs作为miRNA的海绵吸附分子，参与肿瘤的发生发展进程[15]。circRNAs参与间充质干细胞生理过程的研究报道较少，仅报道雌激素受体β(ERβ)通过2:27713879/27755789/2:240822115/240867796-miR-328-5p-mRNA轴调控MSCs的成骨分化[16]。circRNAs及其相互作用的miRNAs在BMSCs成骨分化过程中起重要作用[17]。而miRNA对间充质干细胞的影响研究报道较多，涉及到间充质干细胞的细胞周期、增殖、分化和迁移等生理过程[18-19]。已有报道miR-21在间充质干细胞中强表达，通过调控BMPR2、SPRY1、TGFBR2和BMP促进间充质干细胞成骨成脂分化，通过调控Sox2抑制细胞增殖，通过调控PDCD4、SPRY1、SPRY2和PTEN等增强细胞存活，保护细胞线粒体功能避免线粒体凋亡[20-21]。miR-27b通过调控SDF-1α的表达量，影响间充质干细胞的迁移能力，通过靶向转录因子PPARγ和C/EBPα抑制脂肪形成,通过调控APC、SATB2和手性钙结合蛋白影响成骨分化[22-23]。

本研究中，用生物信息学技术分析低氧预处理人胎盘绒毛膜间充质干细胞circRNA的靶结合位点，软件预测circRNA的结合miRNA及其靶基因。GO分析表明细胞发育等是差异表达circRNAs的主要功能，hsa_circRNA_005232和hsa_circRNA_102700分别作用miR-27a-3p、miR-27b-3p和miR-373-5p，而hsa_circRNA_102854作用miR-21-3p。提示这些差异表达的circRNAs可能影响低氧预处理间充质干细胞的增殖和分化等特性。信号通路富集分析显示“Transcriptional misregulation in cancer”和“mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathway”为最有意义的通路，提示这些circRNAs可能影响低氧预处理间充质干细胞的基因组稳定性和细胞特性。差异表达circRNAs的生物信息分析结果和已有报道的低氧预处理影响间充质干细胞生物学特性研究结论相一致[6-7]。

本研究表明，MAPK通路为低氧预处理间充质干细胞的核心通路，表明circRNAs通过该通路参与多种细胞功能相关，可参与细胞运动、凋亡、分化及生长增殖等多种生理过程[24-25]。目前确定有4条MAPK信号转导通路：extracellular signal regulated kinase (ERK) signaling pathway, c-Jun N-terminal kinase (JNK) signaling pathway、p38 signaling pathway and ERK5 signaling pathway。在MAPK家族成员中。ERK、p38和JNK参与了hMSCs分化的信号转导[26]。ERK-MAPK在细胞整个发育过程中均可激活，与细胞增殖和起始分化密切相关，而p38和JNK信号通路很可能是在细胞分化晚期或者凋亡阶段发挥作用[24,27]。

本研究表明，低氧预处理人胎盘绒毛膜间充质干细胞环状RNAs同低氧预处理间充质干细胞的生物学特性变化密切有关，为了解低氧预处理影响间充质干细胞特性发生变化的分子机制提供新思路，为进一步实验研究提供指引和理论依据。