血清外泌体对小鼠烫伤伤口愈合的促进作用及机制研究

郭建忠 杨 磊

1 惠州市中心医院分院博罗县人民医院手足整形烧伤科(惠州 516100) 2 南方医科大学南方医院烧伤科(广州 510515)

烫伤属于皮肤外科常见的疾病类型，具有较高的发病率，通常是因为不小心接触滚烫液体或者金属所致，属于一种意外人身伤害。特别是对于儿童群体而言，由于年龄和生活经验的原因，安全意识并不是非常高，可能接触的高温物体更频繁，发生烫伤的可能性更大[1]。烫伤的危害性比较高，若烫伤后未得到及时有效的处理，则极有可能引发严重的后果，导致皮肤感染和坏死，影响外观容貌的同时，甚至造成残疾。外泌体由细胞分泌释放而来，广泛存在于全身各处，能够与烫伤部位和创面直接发生接触[2]。血清作为血液的主要成分，大量的外泌体存在其中，外泌体是否会对烫伤创面的愈合产生作用，若产生作用其机制又如何，目前临床鲜有报道，因而加强对血清外泌体对烫伤创口愈合的作用和机制研究具有较高的价值和意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取60只NIH小鼠进行研究，对小鼠血液进行抽取，抽取后静置60min，2000 r/min状态下离心处理，离心处理结束15min后对血清予以分离。2000 r/min的状态下离心处理，30min后将细胞碎片去除，并转移至新离心管中，每支离心管血清含量为1 mL。对外泌体进行提取，提取时的操作必须以试剂盒及相关操作说明为准，严格操作，保证质量。外泌体提取完成后，检测蛋白样品的浓度(采用BCA法)，采取SDS-PAGE电泳处理，之后转膜，TBS/T洗3次。脱脂奶粉在室温环境下封闭处理(12 h)。TBS/T洗3次后加入一抗，冰箱孵育过夜，温度4℃。回收一抗，TBS/T洗3次，相对应二抗加入，室温环境下孵育，时间1 h。TBS/T洗3次，显影、定影。

1.2 皮肤烫伤模型建立和血清外泌体治疗

小鼠体质量18～22g，麻醉药物为10%水合氯醛，麻醉后对小鼠背部进行脱毛处理，同时常规消毒。小鼠背部方在烫伤装置上造模，水浴锅和隔热木板为烫伤装置的核心构成部分，在隔热板木板上设有孔径6 mm的圆洞。控制好水浴锅的温度为85℃，掌控好烫伤时间为8s。每只小鼠背部两侧各烫出直径6 mm的圆形创面，选择其中烫伤的一侧，将100 μL PBS重悬的外泌体注射，另一侧则在烫伤周围注射100 μL PBS重悬外泌体，形成自身对照。见图1～2。

图1 为烫伤后皮肤组织情况(胶原纤维大量增生)

图2 小鼠烫伤治疗后皮肤组织的情况(皮肤坏死明显恢复)

1.3 MTT实验

处于对数生长期的小鼠成纤维细胞接种于96孔板，接种密度为1.5×104个/mL，每孔细胞悬液，剂量控制为相同100 μL(4组，每组3复孔)。观察细胞贴壁情况，完全贴壁，吸弃培养液，PBS洗3次。每孔加入100 μL DMEM培养基，加入3种浓度不同的外泌体悬液，空白组加入等量PBS，进行培养，时间为24 h，每孔将20 μL MTT加入其中，放置在培养箱中进行孵育，孵育时间为4 h，并将上层清液吸弃，每孔加入150 μL DMSO，振荡混匀，10min后用酶标仪对吸光值进行检测。

1.4 细胞划痕实验

处于对数生长期的表皮细胞HaCat接种于12孔板，接种密度为25×104个/mL。每孔加入1 mL细胞悬液(设置2组，每组3复孔)。观察细胞贴壁情况，完全贴壁后每孔底部中间划细线(使用200 μL枪头操作)，培养液吸弃，PBS洗3次。DMEM培养基和外泌体悬液的加入及其培养同MTT实验，使用显微镜拍摄细胞迁移情况。

1.5 统计学处理

数据分析使用SPSS21.0统计软件包，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 血清外泌体对小鼠烫伤创口愈合影响

动物整体实验显示，与空白对照相比较，采用血清外泌体后，小鼠烫伤创口愈合时间缩短，说明血清外泌体可以促进小鼠烫伤创口的愈合。见表1：

n烫伤创口愈合时间(d)空白对照组607.15±2.36血清外泌体组604.71±1.68t—6.524P—<0.001

2.2 血清外泌体对成纤维细胞增殖的影响

血清外泌体作用24 h后，PBS、2 μL Exo组、5 μL Exo组、10 μL Exo组均对成纤维细胞增殖产生了促进作用，并且呈现出一定的剂量依赖性。在OD值方面，PBS为(0.63±0.12)，2 μL Exo组为(0.77±0.10)，5 μL Exo组为(1.06±0.09)，10 μL Exo组为(1.17±0.09)，各组OD值差异均有统计学意义(P<0.05)。其中，10 μL Exo组和PBS组外泌体除了呈现剂量依赖性外，还呈现一定的时间依赖性。10 μL Exo组OD值0d为(0.56±0.08)，第一天为(1.11±0.16)，第二天为(1.36±0.21)，第三天为(1.44±0.16)，各时间点OD值差异均有统计学意义(P<0.05)；PBS组OD值为(0.57±0.08)，第一天为(0.73±0.11)，第二天为(1.04±0.15),第三天为(1.12±0.14)；各时间点OD值差异均有统计学意义(P<0.05)。

2.3 血清外泌体对表皮HaCat细胞迁移影响

HaCat细胞的迁移会受到血清外泌体的显著影响，外泌体组和PBS组24 h的HaCat细胞迁移率相比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2：

nHaCat细胞迁移率/%外泌体组6064.03±5.12PBS组6032.89±4.03t—37.019P—<0.001

3 讨 论

外泌体于1983年被发现，但是一直以来临床对其的重视程度都比较低。近年来，临床对外泌体的研究逐渐增多，大量的研究实践表明外泌体在免疫中抗原呈递、组织损伤的修复、肿瘤的生长和迁移等方面有着十分显著的作用[3]。

烫伤作为临床皮肤外科常见的疾病类型，组织的修复对皮肤的健康恢复至关重要。一般而言，受损皮肤组织的修复，不仅能依靠原来性质的细胞进行修复，这样的修复效果往往不够理想。研究表明，通过成纤维细胞增生填补受损的组织，可以很大程度上提升伤口的愈合率[4]。在繁殖速度方面，成纤维细胞比较快，快速的繁殖速度，能够在很大程度上较快合成和分泌胶原纤维与基质成分与新生毛细血管形成肉芽组织的速度，形成的新肉芽组织，用于填补坏死皮肤组织，从而为表皮细胞覆盖创造良好的条件[5]。随着烫伤修复进程的推进，硬痂会不断脱落，表皮细胞的迁移也会随之完成覆盖[6]。血清外泌体广泛存在于血清中，其直径大约为40～100 nm，在血液等体液内传播，其作用机制表现为：携带mRNA，MicroRNA和蛋白质等生物活性分子，介导细胞间通讯，发挥相应的功能作用[7]。血清中含有大量的外泌体，本研究针对性地研究了血清外泌体对烫伤伤口创面愈合的影响，结果发现其作用是积极的，尤其是在缩短创面愈合的时间方面作用显著，与此同时，对于血清外泌体对成纤维细胞增殖，表皮HaCat细胞迁移会也会形成积极的作用，可以促进二者的增殖和迁移，而这也能够在一定程度上用于解释对烫伤伤口创面愈合的积极影响。此外，本研究血清外泌体的给药方式为皮下注射，与传统外敷涂抹用药不同的是，该给药方式几乎不受皮肤通透性的影响，效果更明显，作用更为直接[8]。

综上所述，血清外泌体通过对成纤维细胞增殖和表皮HaCat细胞迁移会产生促进作用，进而作用于烫伤伤口创面的愈合，这在很大程度上为皮肤烫伤的治疗提供了更多有价值的参考信息。