ABCB1基因G2677T、C3435T多态性与阿托伐他汀降脂疗效的关系

堵正洁 沈珍贤

1 无锡市惠山区人民医院 (无锡 214151)2 南京医科大学附属无锡精神卫生中心 (无锡 214151)

近年来，随着人们生活水平的提高，我国心血管疾病患病率及死亡率处于上升趋势[1]。研究表明，心血管疾病的发生发展与血脂异常密切相关[2]。血脂异常是脂质代谢紊乱、转运异常的表现，包括血清总胆固醇(TC)、血清甘油三酯(TG)、血清低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平升高，以及血清高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平降低[3]。阿托伐他汀属于羟甲基戊二酸辅酶A还原酶抑制剂，目前在临床上广泛用于降脂和稳定动脉硬化斑块治疗[4]。阿托伐他汀在体内主要通过抑制3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶来抑制胆固醇的合成，从而使血浆TC、TG、LDL-C水平降低，同时使HDL-C水平轻度升高。然而，不同患者之间阿托伐他汀调脂疗效差异较大[5]，有研究表明，阿托伐他汀是ATP结合盒亚家族B(MDR / TAP)成员1转运蛋白(ATP-binding cassette, sub-family B (MDR/TAP), member 1,ABCB1)的基因表达产物——P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)的特异性的转运底物[6]。在已发现的ABCB1的近50个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)中，外显子26的C3435T和外显子21的G2677T/A 均能够影响P-gp的转运底物，很可能致阿托伐他汀疗效的个体化差异出现[7]。目前国内对于ABCB1基因SNPs与血脂异常及调脂疗效相关性研究比较少，故本研究率先从临床的角度出发，初步探讨了ABCB1基因G2677T、C3435T多态性与阿托伐他汀降脂疗效的关系，为今后临床的个体化降脂治疗方案的制订提供了依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象

2014年1月—2016年1月收集无锡市精神卫生中心血脂异常住院患者，受试者纳入标准：符合2007年中国成人血脂异常防治指南[8]，患者血脂水平至少符合一项以下血脂参照标准，TC≥5.18 mmol/L，TG≥1.70 mmol/L，LDL-C≥3.37 mmol/L，HDL-C≤1.04 mmol/L；①研究前2周未服用过各类降脂相关药物；②研究前2周未服用过影响血脂水平及影响阿托伐他汀代谢的药物。

排除标准：①有继发性血脂异常、活动性肝病、严重肾功能不全、对阿托伐他汀中任何成分过敏、严重创伤或重大手术者；②孕妇或可能受孕的育龄女性；③哺乳期妇女；④吸烟饮酒患者。

共收集205例汉族患者，其中男127例，女78例，年龄24～94岁，平均(65.65±13.65)岁，病程3～24个月，平均(13.10±6.02)个月。

1.2 试剂与仪器

氯仿、异丙醇、乙醇等为国产分析纯试剂，使用时按需要配制。Reveres Transcription PCR相关试剂：焦炭酸二乙酯(DEPC)、Trizol RNA提取液、逆转录试剂盒，Taq聚合酶、100 bp DNA Ladder、琼脂糖均购自大连宝生生物工程有限公司。PCR引物设计，该实验采用的引物均为GenBank 获取cDNA 全序列后，均由上海Invitrogen公司合成。

垂直电泳槽与 Gel DOC 2000 凝胶成像系统(美国Bio-RAD 公司),PCR扩增仪(德国 Eppendorf 公司),全自动紫外分光光度计Du640(美国Beekman公司)，高速冷冻离心机(德国Heraeus公司),罗氏全自动血生化分析仪Modlar P800(德国罗氏公司)。

1.3 治疗方法与分组

患者均单一服用阿托伐他汀钙胶囊(国药准字H20051984，10 mg/片，天方药业有限公司)20 mg每天，连续服用3个月。服药期间的3个月除阿托伐他汀外均未服用过其他影响血脂水平及其代谢的药物，无冠心病、高血压病史、糖尿病，心电图检查均正常。治疗3个月后均进行4项血脂指标检测。将205例患者治疗3个月后4项指标TC、TG、LDL-C、HDL-C恢复正常分为A组，治疗后4项指标仍有一项及一项以上异常分为B组。

1.4 ABCB1基因分型

抽取外周静脉血2 mL，置于乙二胺四乙酸二钠(EDTA)抗凝管中，-80℃保存。采用酚-氯仿法200 μL抽提DNA，紫外分光光度法测定各样本DNA浓度。采用聚合酶链式反应—限制性片段长度多态分析(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP) 方法分析患者的基因分型。PCR引物序列为，ABCB1 G2677T正向引物：5′-AGTTTTCAGAAAATAGAAG CATGAGT-3′；反向引物：5′-GGGAGTAACAAAA TAACACTGATTAGA-3′。ABCB1 C3435T正向引物：5′-TGTGCTGGTCCTGAAGTT-3′；反向引物：5′-TAGGCAGTGACTCGATGAA-3′。PCR反应体系：反应总体积50 μL，包含Ex Taq (5U/μL),10× Buffer 5 μL，dNTP Mixture (各2.5 mmol) 4 μL，模板DNA 2.5 ng，引物各1 μL；PCR反应条件：ABCB1 G2677T：94 ℃预变性3min，94 ℃变性30s，61 ℃退火30s，72 ℃延伸1min，共35个循环，72 ℃再延伸7min，PCR产物片段351 bp。ABCB1 C3435T：94 ℃预变性3min，94 ℃变性40s，52.0 ℃退火 1min，72 ℃延伸 1min，共35个循环，72 ℃再延伸7min，PCR产物片段246 bp。酶切及电泳: 用NIaⅢ限制性内切酶酶切，37 ℃ 4 h后以15%聚丙烯酰胺凝胶电泳，EB染色，紫外灯下观察分型。

1.5 统计学方法

2 结 果

2.1 患者的基本资料

对205例患者年龄、病程进行正态性检验，发现符合正态分布。其中，A组患者130例，男80例、女50例，年龄32～94岁、平均(67.00±12.44)岁，病程3～23个月、平均(12.78±5.93)个月；B组患者75例，男47例、女28例，年龄24～91岁、平均(63.32±15.34)岁，病程3～24个月、平均(13.68±6.17)个月。两组患者的年龄、病程比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1患者年龄和病程分布

表3A组和B组ABCB1基因G2677T、C3435T基因型和等位基因频率

2.2 ABCB1基因G2677T、C3435T基因型及等位基因频率分布

经吻合度检验，患者基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)，表明样本来自同一蒙德尔群体，样本具有代表性。205例患者中G2677T位点GG型、GT型、TT型基因频率分别为19.51%、42.44%、38.05%；等位基因G和T频率分别为40.73%和59.27%。C3435T位点CC型、CT型、TT型基因频率分别为34.63%、49.76%、15.61%；等位基因C和T频率分别为59.51%和40.49%。

G2677T位点A组与B组等位基因突变率为58.46%与60.67%，A组GG型、GT型、TT型基因频率分别为23.08%、36.92%、40.00%，B组GG型、GT型、TT型基因频率分别为13.33%、52.00%、34.67%；C3435T位点A组与B组等位基因突变率为40.77%和40.00%，A组CC型、CT型、TT型基因频率分别为34.62%、 49.23%、16.15%，B组CC型、CT型、TT型基因频率分别为34.67%、50.67%、14.66%。χ2检验结果显示，A组和B组患者ABCB1基因G2677T、C3435T基因型和等位基因频率比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，见表2～3。

表2患者基因型分布(G2677T、C3435T)

2.3 用药前ABCB1基因G2677T、C3435T多态性与4项血脂指标的关系

对205例患者用药前4项血脂指标进行正态性检验，发现TG、TC、HDL-C、LDL-C经自然对数转换后符合正态分布。服药前，基因G2677T各基因型患者血浆TG、HDL-C水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；TT型患者血浆TC、LDL-C水平高于GT型患者，差异均有统计学意义(P<0.05)，而GG型患者TC、LDL-C水平与分别与GT、TT型患者比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。基因C3435T各基因型患者血浆TG、TC、HDL-C、LDL-C水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)见表4。

表4阿托伐他汀治疗前ABCB1 G2677T、C3435T不同基因型间血脂水平比较(M±Q)

与GT型患者比较：#P<0.05

2.4 用药后ABCB1基因G2677T、C3435T多态性与4项血脂指标的关系

对205例患者用药后4项血脂指标进行正态性检验，发现用药后TG、TC、HDL-C、LDL-C经自然对数转换后符合正态分布。服药后，基因G2677T各基因型患者血浆TG水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；GT型患者血浆TC、HDL-C、 LDL-C水平低于GG型和TT型患者，差异均有统计学意义(P<0.05)，而GG型与TT型患者TC、HDL-C、LDL-C水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。基因C3435T各基因型患者血浆TG、HDL-C水平比较，差异均无统计意义(P>0.05)；TT型患者血浆TC水平低于CC型和CT型患者，差异均有统计学意义(P<0.05)，而CC型与CT型患者TC水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)；TT型患者血浆LDL-C水平低于CC型患者，差异均有统计学意义(P<0.05)，而CT型患者LDL-C水平分别于CC型、TT型比较无差异(P>0.05)。见表5。

表5阿托伐他汀治疗后ABCB1 G2677T、C3435T不同基因型间血脂水平比较(M±Q)

与GG、TT型患者比较：*P<0.05；与CC、CT型患者比较：#P<0.05；与CC型患者比较：**P<0.05

2.5 用药前后4项血脂指标的比较

对阿托伐他汀用药前后4项血脂水平的差值进行正态性检验，发现用药前后血浆TC、HDL-C、LDL-C水平的差值服从正态分布，而TG用药前后的差值经自然对数转换后也达到正态分布。与用药前相比，用药后血浆TC、LDL-C水平降低，HDL-C水平升高，与用药前比较差异均有统计学意义(P<0.001)。对于TG指标，由于其用药前后差值不符合正态分布，经自然对数转换后达到正态分布后进行配对t检验，用药前Ln(TG)水平(0.42±0.51)高于用药后Ln(TG)水平(0.23±0.36)，差异有统计学意义(P<0.001)，见表6。

表6 阿托伐他汀治疗前后4项血脂水平比较(M±Q)

血脂指标用药前用药后PTG/(mmol/L)1.46±1.211.31±0.56#<0.001TC/(mmol/L)3.70±2.073.62±1.28#<0.001HDL-C/(mmol/L)0.82±0.291.09±0.16#<0.001LDL-C/(mmol/L)1.89±1.381.90±0.96#<0.001

与用药前比较：#P<0.05

2.6 ABCB1基因G2677T、C3435T位点多态性与阿托伐他汀调脂疗效的关系

ABCB1基因G2677T、C3435T各基因型患者血脂水平差值比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，见表7。

表7ABCB1 G2677T、C3435T不同基因型间阿托伐他汀用药前后血脂水平差值比较

▲血脂水平用M±Q表示

3 讨 论

本研究探讨了阿托伐他汀的主要代谢酶ABCB1基因 G2677T、C3435T多态性与阿托伐他汀降脂疗效的关系。ABCB1基因(多药耐药基因，MDR1)编码的P-gp位于肝细胞、小肠上皮细胞顶端及近端小管刷状缘，其功能是将药物由细胞内转运到细胞外，防止药物及其代谢产物积聚细胞内引起毒性反应。ABCB1基因突变将导致P-gp表达异常或功能缺陷[9]，影响药物在体内的代谢，导致阿托伐他汀不同的疗效和不良反应。

随着药物基因组学和分子遗传学的发展，发现ABCB1基因在不同种族人群中至少超过50个SNPs，其中位于编码区域的C1236T、G2677T/A和C3435T 在不同种族人群中均有报道，被认为是影响ABCB1基因功能的3个最常见SNPs，具有重要意义。C1236T、G2677T/A、C3435T等位基因在中国人群的突变率较高，分别为71.9%(C1236T)、50%(G2677T)、12.5%(G2677A)和53.1%(C3435T)，且三者之间存在明显的连锁不平衡[10-14]。且有研究发现在女性高脂血症患者中，ABCB1 3435C>T与阿托伐他汀的疗效有关，服用阿托伐他汀后，CC基因型患者LDL-C下降最少，而各基因型HDL-C升高的幅度依次为CC>CT>TT[15]。临床上已有ABCB1基因C1236T与阿托伐他汀调脂疗效关系的研究，而本研究探讨了ABCB1的另外两个基因位点G2677T和C3435T的多态性与临床阿托伐他汀对降脂的疗效的相关性。

本研究结果显示，ABCB1基因G2677T位点在治疗后4项指标恢复正常人群中等位基因突变率为58.46%，治疗后4项指标仍有一项及一项以上异常人群中等位基因突变率为60.67%；C3435T位点在治疗后4项指标恢复正常人群和仍有一项及一项以上异常人群中等位基因突变率为40.77%和40.00%；ABCB1基因G2677T、C3435T位点基因型及等位基因频率在治疗后4项指标恢复正常人群和仍有一项及一项以上异常人群中分布并无明显差异。205例患者中，用药前ABCB1基因G2677T位点TT型血浆TC、LDL-C水平高于GT型(P<0.05)。用药后ABCB1基因G2677T位点GT型血浆TC、HDL-C、LDL-C水平低于GG型与TT型(P<0.05)；用药后ABCB1基因C3435T位点TT型血浆TC水平低于CC与CT型(P<0.05)，而CC型血浆LDL-C水平高于TT型(P<0.05)；综上所述ABCB1基因G2677T位点和C3435T位点SNPs与血脂水平有关，可为临床治疗提供依据。经20 mg/d阿托伐他汀治疗3个月后，血浆TG、TC、LDL-C水平降低，HDL-C水平升高，说明阿托伐他汀具有良好的降血脂效果。而治疗前后4项指标的差值与ABCB1基因G2677T、C3435T位点SNPs无关，说明ABCB1基因G2677T位点和C3435T位点SNPs可能与阿托伐他汀降脂疗效无关。

目前，大部分有关基因多态性对他汀类药物影响的研究，都只考虑某一种多态性对他汀类药物的影响，而他汀类药物在体内的代谢、转运、产生药效的过程十分复杂，影响因素众多，单个遗传决定因素难以全面反应多态性所致影响，同时考虑多个基因联合效应更具现实意义[16]。阿托伐他汀的药物基因组学研究是目前冠心病和动脉粥样硬化治疗领域中的新进展，有关药物代谢酶、转运体以及脂质代谢相关基因多态性对阿托伐他汀药物疗效的影响，国内外已有很多研究，但其仍处于一个起步阶段，缺乏多个基因位点的单倍体研究，对于突变位点的功能意义研究尚需完善，缺乏多人种、多种族的大样本研究，缺乏药物转运体与代谢酶对药动学和药效学影响的联合研究[17]。有报道研究发现影响阿托伐他汀降脂效果的可能机制较多，并且除ABCB1 G2677T和C3435T多态性之外，其它位点的多态性也可能影响阿托伐他汀的降脂效果；而且同一基因不同位点的SNPs之间存在很多连锁关系，单一位点的SNPs可能本身并不改变编码蛋白质的表达而是通过与临近的或潜在的与蛋白质表达相关的SNPs连锁共同起作用[18]。有些因素如环境、药物、饮食、运动之间相互作用等，也可能会影响血脂水平。

本研究并未测定患者血药浓度，无法进一步分析结果；而且本研究只检测了总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)4个指标，尚有其他血脂指标未进行检测分析。所以本研究后期可以通过完善实验方法，增加SNPs研究位点并分析相互之间连锁关系，增加血脂指标检测，尽可能消除影响因素，提高实验设计的科学性、严谨性与合理性，进一步研究ABCB1基因G2677T、C3435T位点SNPs与血脂水平和阿托伐他汀调脂疗效的相关性，从而为个体化治疗提供临床依据。随着新技术及新研究方法的不断改进完善，相信在不久的将来，阿托伐他汀的个体化降脂治疗会更加完善。