Nrf2、HO-1在经典型霍奇金淋巴瘤的表达与其临床特征的关系

薛 丽 伊雪梅 张 婧 党雅梅 赵凤辉 李红玲

经典型霍奇金淋巴瘤(classical Hodgkin′s lymphoma, cHL) 是一种起源于淋巴造血系统的恶性肿瘤，占所有霍奇金淋巴瘤的95%，好发于青年及老年人[1]。cHL患者的预后较好，70%～80%的患者经过规范化治疗可达到5年的生存率，但仍有5%～10%的患者会出现耐药，10%～30%的患者会出现缓解后复发，从而表现为复发难治和较差的预后[2, 3]。氧化应激是由活性氧(reactive oxygen species，ROS)产生与细胞抗氧化能力之间失衡而导致机体处于的病理状态。研究表明，氧化应激与肿瘤的发生、发展具有一定的相关性[4]。相对高浓度的ROS的细胞内积累可诱导DNA的氧化损伤，这可能参与肿瘤的发生、发展，与氧化应激相关的凋亡信号途径的有关基因很可能会对肿瘤的治疗提供参考。核因子E2相关因子(nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2)属于 Cap-n-collar (CNC)家族，是具有碱性亮氨酸拉链结构的转录因子，广泛存在于机体各个器官，是细胞对抗氧化应激反应的主控调节因子[5]。正常情况下，Nrf2的活化可预防心血管疾病、肺纤维化、糖尿病、衰老、神经退行性疾病、肿瘤等的发生[6]。血红素氧合酶-1 (heme oxygenase-1，HO-1)是一种诱导性微粒体催化酶，具有抗炎、抗氧化、抗细胞凋亡等作用[7]。然而，许多研究表明，Nrf2和HO-1在许多人类肿瘤中异常高表达，且其高表达与肿瘤细胞增殖、侵袭转移、化学抗性等生物学行为有关[8]。本研究通过SP免疫组化法检测Nrf2和HO-1在cHL组织中的表达，初步探讨Nrf2和HO-1在cHL发生、发展中可能发挥的作用。

材料与方法

1.临床资料:收集2012年1月～2017年12月由笔者医院确诊的42例初发cHL患者的资料和标本，其中男性27例，女性15例；患者年龄5～78岁，中位年龄39.5岁。所有患者经病理及免疫组化确诊为cHL。其诊断及分类标准依据WHO 2016年版《淋巴造血系统肿瘤分类标准》，结节硬化性19例，混合型16例，淋巴细胞丰富性7例。所有患者临床资料完整。并收集同期诊治的23例淋巴结反应增生患者作为对照组，患者年龄9～67岁，中位年龄42岁。本研究经笔者医院伦理学委员会批准，患者知情同意。

2.免疫组化：兔抗人Nrf2多克隆抗体(rabbit anti-Nrf2 antibody，ab137550)和兔抗人HO-1多克隆抗体(rabbit anti-HO-1 antibody，ab13243)购自英国Abcam 公司；免疫组化SP试剂盒购自北京博奥森生物技术有限公司。所有标本均经10%甲醛缓冲液固定，常规石蜡包埋，制作4μm切片，行免疫组化染色。SP免疫组化法严格按试剂盒说明书进行操作。Nrf2和HO-1工作浓度均为1∶100。所有切片采用柠檬酸缓冲液煮沸进行修复抗原，以 PBS 代替一抗作为阴性对照。

3.结果判定：采用双评分半定量法进行评分，在每张载玻片上随机选取5个视野，并且在每个高倍视野(×400)下计数100个细胞。根据染色强度和阳性细胞的百分比2种计分方式进行综合评分。结果判定由笔者医院两位资深病理学专家进行双盲法评估。Nrf2 和HO-1的阳性表达均主要见于细胞核内，呈黄色、棕黄色或棕褐色颗粒。依据阳性细胞百分比：≤5%计为0分，6%～25% 计为1分，26%～50% 计为2分，≥51% 计为3分。依据染色强度：无染色计为0分，弱染色计为1分，中等染色计为2分，强染色计为3分。将两个分数相乘即染色指数得最终诊断标准: 0 分为(-)，1～9分为阳性，其中1～3分为弱阳性(+)，4～6分为中等阳性(++)，7～9分为强阳性(+++)。本实验以+～+++为阳性表达。

4.统计学方法：应用SPSS 23.0统计学软件对数据进行统计处理。组间比较采用χ2检验[n≥40，且所有理论频数(T)≥5]或连续校正χ2检验(n≥40，但有1≤T<5)。Nrf2和HO-1表达水平的相关性采用Spearman相关性分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.Nrf2在cHL及淋巴结反应增生组织中的的表达:Nrf2的阳性表达主要见于细胞核中，呈棕黄色或棕褐色颗粒。Nrf2在cHL和淋巴结反应增生组织中的阳性表达分别为 42.9%和13.0%，差异有统计学意义(P<0.05，表1，图1) 。

表1 Nrf2、HO-1在cHL和淋巴结反应增生组织中的表达 [n(%)]

图1 Nrf2在cHL组织中的表达(SP，×400)A.Nrf2表达呈阴性(-);B.Nrf2表达呈弱阳性(+);C.Nrf2表达呈中等阳性(++);D.Nrf2表达呈强阳性(+++)

2.HO-1在cHL及淋巴结反应增生组织中的的表达:HO-1的阳性表达主要见于细胞核中，呈棕黄色或棕褐色颗粒。HO-1在cHL和淋巴结反应增生组织中的阳性表达分别为 47.6%和17.4%，差异有统计学意义(P<0.05，表1，图2)。

图2 HO-1在cHL组织中的表达(SP,×400)A.HO-1表达呈阴性(-);B.HO-1表达呈弱阳性(+);C.HO-1表达呈中等阳性(++);D.HO-1表达呈强阳性(+++)

3.Nrf2、HO-1的表达与cHL临床病理特征的关系:Nrf2、 HO-1在cHL组织中的表达均与患者性别，年龄，LDH，病理分型无关(P>0.05)，而与Ann Arbor stage临床分期，B症状有关(P<0.05)。临床分期 Ⅲ～Ⅳ期患者Nrf2、HO-1阳性表达(分别为61.5%和65.4%)高于Ⅰ～Ⅱ期患者(分别为12.5%和18.8%)；Nrf2、HO-1在有B症状患者中的阳性表达(分别为62.5%和75.0%)高于无B症状患者(分别为16.7%和11.1%),详见表2。

表2 Nrf2、HO-1的表达与cHL临床病理特征的关系 [n(%)]

4.Nrf2与HO-1在cHL组织中表达的相关性：在cHL组织中，Nrf2 与HO-1 蛋白的表达呈正相关 (r=0.619，P<0.05，表3)。

表3 Nrf2、HO-1在cHL中表达的相关性分析 (n)

讨 论

Nrf2是调控细胞对抗异源性物质和氧化损伤的关键转录因子。Nrf2的活性主要由Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(Kelch-1ike ECH-associated protein l，Keap1)负性调节，生理状态下，Nrf2 与Keap1偶联并与胞质肌动蛋白结合被锚定在胞质，从而促进Nrf2被泛素蛋白酶体 (Cul3 E3) 降解，导致Nrf2的表达量维持在较低水平以维持基本转录。当机体处于氧化应激状态时，Nrf2与Keap1解偶联并转移入核，与Maf蛋白结合成异二聚体后识别并与抗氧化反应元件(antioxidant response element，ARE)结合，从而激活多种抗氧化基因和解毒基因的转录，包括HO-1，作为细胞对氧化损伤的一种保护性反应[9]。因此，传统上Nrf2一直被认为是介导细胞防御反应的重要因子，协助抵抗氧化应激损伤，保护细胞免受化学物质的损害，成为化学预防研究领域的热点。然而，越来越多的研究表明，Nrf2不仅可以保护正常细胞转化为肿瘤细胞，而且还可以保护肿瘤细胞免受氧化应激以及放化疗损伤，从而有助于肿瘤细胞生长[10]。文献报道，Nrf2在多种人类肿瘤如胃癌、卵巢癌、胰腺癌等中表达均上调，它的持续异常活化与肿瘤进展，侵袭转移以及放疗、化疗抗性有关[11～13]。迄今为止，Nrf2在cHL组织中的表达及意义尚未见文献报道。

HO-1被认为是Nrf2下游细胞应答的主要效应物之一，它是血红素代谢的限速酶，能将血红素降解为胆红素、一氧化碳(CO)和铁离子(Fe2+)，三者均在维持细胞稳态中发挥着重要作用[14]。它是一种在多数哺乳动物组织中以低水平存在的应激蛋白，其表达由多种刺激诱导，包括缺氧、重金属、内毒素、细胞因子、血红素、一氧化氮及紫外线照射[15]。HO-1及其代谢产物在保护健康细胞及细胞应激的适应性反应中发挥关键作用，因其可通过抵抗ROS介导的致癌作用来预防它们转化为恶性细胞[16]。然而，HO-1被发现在人类多种肿瘤中高表达并与生物学行为密切相关。Tsai等[17]发现HO-1高表达与非小细胞肺癌的侵袭转移有关。Noh等[18]发现HO-1对乳腺癌的预后具有指导意义。Huang等[19]发现HO-1上调抑制了弥漫大B细胞淋巴瘤细胞凋亡。Mayerhofer等[20]发现在慢性粒细胞白血病中HO-1与伊马替尼耐药有关。Cerny-Reiterer等[21]发现HO-1是急性淋巴细胞白血病中必不可少的生存因子和潜在的新靶标。目前，HO-1在cHL组织中的临床价值尚缺乏相关研究。

本研究通过免疫组化法检测发现，Nrf2和HO-1在cHL组织中均呈高表达，且染色反应主要定位于细胞核内，这一结果与两者在其他许多恶性肿瘤中的表达基本一致，这可能对cHL的临床治疗具有一定指导意义。此外，笔者还分析了Nrf2和HO-1表达与临床病理特征间的关系，发现随着cHL临床分期越晚，Nrf2和HO-1的表达越高(Ⅲ～Ⅳ期患者高于Ⅰ～Ⅱ期)；同时发现两者在有B症状cHL患者中的表达高于无B症状者，目前有研究已明确表明B症状与霍奇金淋巴瘤的不良预后有关，这些结果表明Nrf2和HO-1的表达可能与cHL的进展有关。而且，笔者还发现Nrf2与HO-1在cHL组织中的表达呈正相关，这表明Nrf2/HO-1信号通路对cHL的发生、发展具有重要的生物学作用，Nrf2可能对 HO-1 的生成起到正向调节作用,两者具有协同作用，其可能归因于恶性转化过程中细胞的应激反应和自我保护作用。然而，由于本研究未对以上患者进行随访，中位生存期未知，因此Nrf2和HO-1是否与cHL患者的不良预后有关有待深入研究。而且，本研究样本量相对较小，具有一定的局限性，确切的分子机制需要扩大样本量进一步研究。

综上所述，本研究通过探讨Nrf2和HO-1在cHL中的表达，发现两者在cHL的发生、发展中起着重要作用。通过Nrf2/HO-1通路抗肿瘤作用值得深入研究,如Nrf2和HO-1基因可能为药物治疗提供新途径。总之，Nrf2/HO-1通路有望为肿瘤的分子治疗提供新的临床思路。