PCBP1对6-OHDA作用的HA细胞生长状况的影响

贾冰冰 叶 梦 霍丽蓉

帕金森病(Parkinson′s disease，PD)在神经退行性疾病中流行趋势位居第二，表现为肌肉僵直、运动迟缓、肌强直和静止性震颤[1，2]。PD的特征在于纹状体区黑质致密部的多巴胺能神经元进行性坏死和缺失，虽然通过使用左旋多巴、多巴胺脱羧酶抑制剂、多巴胺激动剂和深部脑刺激等方法，临床症状可以得到一定改善，但此类方法未能阻止神经元变性死亡[3～5]。PCBP1含有3个KH同源域。在哺乳动物中，PCBP1可通过KH同源域识别并结合含多聚胞嘧啶的DNA和RNA序列。PCBP1在细胞质和细胞核中均可表达，但主要定位于细胞核。PCBP1基因可被翻译为具有多功能、多聚胞嘧啶特性的核酸结合蛋白。PCBP1通过与多聚胞嘧啶结合的特性在基因表达中起着重要作用，如mRNA稳定、RNA剪切、特殊基因的转录调控等[6，7]。本研究通过将pEGFP/N-PCBP1重组质粒转染HA细胞，再加入神经毒素6-OHDA后，探讨PCBP1基因的过表达对人星形胶质细胞生长状况的影响。

材料与方法

1.材料和试剂：人星形胶质细胞由首都医科大学附属北京天坛医院神经外科研究所惠赠。各种细胞培养基购自美国Gibicol公司；台盼蓝购自北京索莱宝生物科技有限公司。CCK-8试剂盒、卡那霉素、限制性内切酶EcoRⅠ、感受态细胞制备试剂盒、质粒提取试剂盒购自上海生物工程有限公司。LipofectamineTM2000购自美国Invitrogen公司。pEGFP/N-PCBP1重组质粒为笔者研究室保存。

2.重组质粒pEGFP/N1-PCBP1扩增与鉴定：以含PCBP1的重组质粒为模板进行聚合酶链式反应(PCR)对目的基因PCBP1进行扩增，上游引物：5′-TTCTAGAATTCATGGATGCCGGTGTGACTGAAAGTG-3′，下游引物:5′-TTCTAGAATTCAACCTACACTGTTCTAG-CTGCACC-3′，目的片段包含PCBP1的起始子及终止子并含有EcoRⅠ酶切位点。将PCR扩增片段用EcoR Ⅰ酶切，进一步纯化后，进行琼脂糖凝胶电泳；将超低温冰箱中取出的感受态细胞置冰上融化，每100μl感受态细胞中加入100pg～10ng待转化质粒，轻柔混匀，于冰上静置30min，将离心管置42℃水浴锅中孵育60s，取出后立即冰上放置2～3min，取适量菌液涂布至卡那霉素抗性的LB平板中，于37℃培养箱中培养过夜。孵育后挑取单个细菌菌落，于含抗生素的液体培养基中，放置在37℃水平摇床上进行扩增12～16h。收集菌液进行质粒提取，将提取质粒以EcoRⅠ酶切，纯化后进行DNA测序，明确重组质粒的准确性。

3.HA的培养和转染：人源星形胶质细胞系HA细胞用含10%FBS,1%青霉素-链霉素混合的培养基，置于37℃，5% CO2细胞培养箱中常规培养，隔天更换培养基。细胞达到90%融合时，1%PBS洗涤两遍，用0.125%的胰酶消化，传代。转染前1天，取对数生长期细胞，经PBS洗涤和胰酶消化后，按照104个/毫升浓度接种到6孔板中，在细胞铺满皿底时，将细胞上清液弃掉，更换为不含双抗的细胞培养基，继续培养8h后，用LipofectamineTM2000转染试剂对HA细胞进行转染，取3μg的pEGFP/N1-PCBP1或pEGFP/N1质粒与250ml的opti-MEM混匀，且将10μl的脂质体与250ml的opti-MEM混匀，室温孵育5min后分别将两种质粒与脂质体进行混匀，室温静置20min,再将混合液逐滴加入细胞培养基中，边滴加边晃动培养皿。转染48h后在倒置荧光显微镜下观察，pEGFP-N1可发绿色荧光。

4.CCK-8法检测PCBP1对6-OHDA作用的HA细胞生长状况的影响：将处于对数生长期的细胞按5×103个接种于96孔细胞培养板中，每孔100μl培养基。将细胞分为pEGFP/N1-PCBP1(实验组)和pEGFP/N1(对照组)，按照上述方法进行转染。转染24h时分别将5、10、20、30μmol/L的6-OHDA滴加到实验组和对照组中，每个样本重复5次。继续培养48h后，每孔加10μl CCK-8溶液，于5%CO2、37℃培养箱孵育3h后，应用酶联免疫仪检测于波长450nm处测定吸光度(A)值。

5.细胞计数法检测：将对数生长期细胞按2×104个接种到12孔培养板中，每孔1.5ml培养基，分别对实验组和对照组细胞进行转染，转染24h时将5、10、20、30μmol/L的6-OHDA滴加到实验组和对照组中，设3个复孔。继续培养48h后，在倒置显微镜下观察细胞密度。同时，将各组细胞经胰酶消化后，制备细胞悬液，经台盼蓝染色后，进行细胞计数。

结 果

1.重组质粒pEGFP/N1-PCBP1的鉴定：重组质粒pEGFP/N1-PCBP1经酶切，纯化后进行DNA测序及琼脂糖凝胶电泳，PCBP1基因插入位点及所编码序列正确(图1)。

图1 DNA测序分析重组质粒pEGFP/N1-PCBP1箭头所指为PCBP1基因插入质粒的相应位点

2.质粒转染HA细胞:用对照质粒 pEGFP/N1和重组pEGFP/N1-PCBP1分别对HA细胞进行转染，转染48h后，在倒置荧光显微镜下观察，pEGFP/N1和pEGFP/N1-PCBP1发出绿色荧光(图2)。

图2 倒置荧光显微镜分析质粒在BV-2细胞中的表达(×20)A.对空载质粒pEGFP/N1在HA细胞中的表达；B.重组质粒pEGFP/N1-PCBP1在HA细胞中的表达

3.PCBP1对6-OHDA作用的HA细胞生长变化的影响：将HA细胞种植于12孔板中，转染后24h，将不同浓度的6-OHDA滴加到实验组和对照组细胞中，继续培养3天开始进行细胞计数和CCK-8法检测细胞A值。细胞计数法和CCK-8法显示,5、10μmol/L 6-OHDA作用下，实验组细胞较对照组增殖加速，差异有统计学意义(P<0.05)。20、30μmol/L 6-OHDA作用下，实验组和对照组的细胞增殖情况比较，差异无统计学意义(P>0.05，图3、图4)。

图3 细胞计数法检测PCBP1转染后对HA细胞增殖的影响与pEGFP/N1组比较，*P<0.05

4.HA细胞转染PCBP1后的生长现象:如图5所示，在5、10μmol/L的6-OHDA作用下，转染PCBP1的HA细胞明显达到80%的汇片率；而20、30μmol/L的6-OHDA作用下，转染PCBP1的HA细胞与对照组细胞的生长状况比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

图4 CCK-8法检测PCBP1转染后对HA细胞增殖的影响与pEGFP/N1组比较，*P<0.05

图5 PCBP1转染后促进细胞生长现象(×20)A.5μmol/L 6-OHDA；B.10μmol/L 6-OHDA；C.20μmol/L 6-OHDA；D.30μmol/L 6-OHDA。1.对照组细胞生长状况；2.实验组细胞生长状况

讨 论

PCBP1在神经系统疾病中的作用逐渐成为目前研究的热点[8]。PCBP1主要通过与多聚胞嘧啶的结合发挥重要生物学作用[9]。PCBP1含有两种核定位信号序列(nuclear localization signal,NLS)，NLS可调节蛋白由细胞质到细胞核的转运。PCBP1可作为特殊基因的转录调控子，参与环境信号转录应答的调节。PCBP1主要参与pre-mRNA的编辑和选择性剪切、mRNA出核和翻译调控等[10,11]。现已发现一种最为严重的核纤层疾病——早老综合征(Hutchinson-Gilford progeria syndrome，HGPS)，与PCBP1可能密切相关，此研究证明在早老综合征细胞中可见Lamin A聚集在核内膜，PCBP1可与Lamin A/C结合又可作为Progerin的相互作用伙伴。PCBP1用于调节早老综合征细胞中的各种RNAs和蛋白质的表达仍有待进一步研究。由此看来，PCBP1可能与细胞的复制分化过程有关，此功能的干预可关系到早老综合征的病理进程[12]。小热休克蛋白(the small heat shock protein,HSPB1)突变可导致严重的周围神经系统疾病[13,14]。Geuens等[15]研究发现，PCBP1可与HSPB1-P182L突变蛋白特异性结合，而导致其翻译抑制活性的降低。通过RNA免疫沉淀法对小鼠大脑RNA测序显示PCBP1 mRNA为HSPB1-P182L突变蛋白作用靶点，且这些靶点由大量的 3′-和5′-UTRs以及丰富的CTCCTCCTCCTCC共有序列组成。因此，在神经退行性疾病中，HSPB1可与PCBP1相互作用降低翻译抑制性。

本研究将PCBP1重组质粒转染SH-SY5Y细胞，通过荧光显微镜观察，PCBP1主要在神经元细胞系SH-SY5Y细胞的胞质和核膜中广泛表达，且细胞生长速度明显增加[16]。在本研究中，重点关注PCBP1对神经系统中星形胶质细胞的作用，在神经毒素6-OHDA作用下，PCBP1对星形胶质细胞的生长情况有何影响。实验中通过CCK-8法和细胞计数法证明，与对照组比较，在低浓度的6-OHDA作用下，转染PCBP1重组基因的HA细胞生长明显加剧。推测可能是由于6-OHDA进入细胞内后激起氧化活性物质(ROS)、超氧化物(H2O2)等产生，进而导致细胞不可逆性死亡[17]。然而，神经细胞坏死的严重程度与6-OHDA的浓度有明显关系[18，19]。本研究初步证明了PCBP1对神经毒素有一定的抗性作用，且在星形胶质细胞生长和发育中起重要作用。