胸腔积液凝集物在组织脱落细胞学诊断中的应用

连国亮 陈 东 商建峰 李彦玮 李 倩

对于有胸腔积液的患者， 常常要抽出积液做细胞学检查， 以证实是否有恶性肿瘤细胞。在常规细胞学诊断中常用直接离心涂片法。但实际应用中，笔者发现涂片法存在涂片厚、细胞重叠、结构不清、细胞量少而阳性检出率低等缺点。特别是对细胞形态不典型的间皮细胞、转移癌细胞的鉴别仅用直接离心涂片法是难以胜任的，常需做免疫组织化学染色检查才能确诊[1～3]。但是直接用涂片做免疫组织化学染色时，常会出现背景深、非特异性着色、阳性不可靠等缺点[4]。近年来细胞蜡块制作的普及已经可以弥补胸腔积液直接涂片不足，但是细胞蜡块的制作步骤繁多，受操作人员技术限制，细胞量可能不能满足诊断工作的需要，因此选取笔者所在科室2015～2017年住院患者胸腔积液298例，其中产生凝集物的标本105例，采用胸腔积液涂片与细胞蜡块及凝集物切片联合检查，凝集物诊断价值可取代复杂的细胞蜡块制作，取得了较满意的效果。现报道如下。

资料与方法

1.一般资料：笔者所在科室2015～2017年住院患者胸腔积液(298例)产生凝集物的标本(105例)，其中男性标本64例，女性标本41例。标本呈深黄色浑浊、浅黄色浑浊、血性，并有胶冻状悬浮状态的凝集物。临床诊断恶性肿瘤胸腔积液88例，胸腔积液原因待查17例。

2.试剂和仪器：CK(AE1/AE3)、Vimentin、calretinin、TTF-1、CK7、NapsinA、p40、CK5/6、p63等免疫组织化学试剂购自中山金桥生物技术公司，HE染色套装购自格林环保试剂公司，10%中性甲醛溶液购自北京益利精细化学，95%乙醇购自北京通广精细化学。Leica Bond-MAX全自动免疫组织化学工作站，莱卡染色封片机。

3.细胞涂片制作方法：取胸腔积液30ml，2500r/min，离心5min，弃上清，取沉淀物在载玻片上采用推拉法进行制片，阴干至不能见明确水分后在95%乙醇内固定15min，然后进行HE染色。

4.细胞蜡块的制作：取胸腔积液100ml分装在两个离心管中，2500r/min，离心5min，弃上清，分别取沉淀物放入10ml软离心管中并加入10%中性甲醛溶液，混匀，2500r/min，离心5min，静置20min。弃上清，加入95%乙醇，混匀，2500r/min，离心5min，静置20min后，定型后可得到圆形细胞块，进行脱水处理。

5.凝集物的收集：用镊子夹取胸腔积液中的凝集物，进行取材，脱水。

6.染色方法：将细胞块和凝集物包埋、切片后，进行HE染色及免疫组织化学CK(AE1/AE3)、Vimentin、calretinin、TTF-1、CK7、NapsinA、p40、CK5/6、p63等染色。

7.统计学方法：采用SPSS 21.0统计学软件对数据进行统计分析处理，两组间计量资料的比较采用配对t检验， 相关性分析以Pearson相关系数表示，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

105例临床送检有凝集物的胸腔积液标本其中采用细胞涂片方法可诊断恶性肿瘤84例，其中5例判断不清，16例非肿瘤性间皮增生。采用细胞蜡块及凝集物制作蜡块的方法均可诊断恶性肿瘤88例，17例非肿瘤性间皮增生，二者诊断结果完全一致。

凝集物制作蜡块与细胞涂片比较显示，细胞量丰富，HE染色色彩鲜艳、胞质、核仁清晰，详见图1、图2。

凝集物蜡块与细胞蜡块进行免疫组织化学染色CK(AE1/AE3)、Vimentin、calretinin、TTF-1、CK7、NapsinA、p40、CK5/6、p63等阳性颗粒定位于细胞膜或细胞质,两组比较差异无统计学意义(P>0.05)，结果完全一致。详见图3～图6。肿瘤脱落细胞诊断结果详见表1，免疫组织化学染色结果详见表2。

讨 论

随着先进的细胞制备技术的发展，在常规的胸腔积液细胞学检查中，采用的方法是将胸腔积液离心，弃去上清液和凝块物，取沉渣涂片2 张，镜检，许多实验室已经摒弃细胞蜡块技术，在笔者看来此种忽视并非合理。细胞蜡块技术应当用于处理细胞学制备完成后的所有残留物质。这些物质常常是包含有价值的诊断证据和不能被细胞学技术所处理的组织碎片。Richardson等研究显示，如果用残留物质的细胞块切片补充涂片技术，那么有5%的液体标本可额外诊断出癌症[5，6]。

图1 细胞涂片(HE染色)A.×10;B.×40

图2 凝集物蜡块(HE染色)A.×10;B.×40

图3 凝集物蜡块(calretinin,×40)

图4 凝集物蜡块(p40,×40)

图5 凝集物蜡块(p63,×40)

图6 凝集物蜡块(TTF-1,×10)

表1 105例胸腔积液细胞涂片、细胞蜡块与胸腔积液凝集物HE染色诊断结果比较(n)

组织活检n恶性肿瘤腺癌(n)鳞癌(n)非肿瘤间皮细胞无法判断细胞涂片1055628165细胞蜡块 1055830170腔腔积液凝集物1055830170

表2 阳性细胞检出率、着色强度及背景着色的检测结果

一个原发或转移肿瘤的重要诊断标志是会出现血色或淡红色渗出液，而渗出液以较高的蛋白含量(通常高于30g/L)为特征，富含纤维蛋白质，静置易于凝固，人们认为它是由纤维蛋白组成，不利于作细胞学涂片，所以凝块物被弃去，但是渗出液中包含各种不同但有诊断价值的细胞团被凝集物包裹、吸附。

笔者选取悬浮状态的凝集物，比重接近胸腔积液，其成分还有待于继续研究，凝集沉淀于瓶底凝集物经过试验发现其大多为血小板凝集产物，吸附或包裹细胞极少，所以不能采用。含有悬浮状态凝集物的胸腔积液占总体送检胸腔积液的35.23%，采取替代细胞蜡块制作可提高工作效率，降低人员劳动强度。

细胞涂片做免疫细胞染色时可能出现如下情况：①由于经过95%乙醇固定，对可能损失某些抗原；②组织内含有H2O2酶，在洗涤的时候可造成脱片；③细胞比较分散，耗费试剂，而且容易出现边缘现象。当面对含有凝集物的胸腔积液时，传统细胞蜡块制作步骤繁多，受操作人员技术限制，获得细胞量可能不能满足诊断需要。笔者将凝集物直接包埋，脱水，不受技术员操作的影响，并且获得丰富的细胞量，组织抗原保持完整，细胞集中。

胸腔积液凝集物包埋切片法收集到的有核细胞多、细胞结构清晰，与细胞涂片相结合，大大提高了细胞学的阳性检出率，对细胞量较少的标本，意义更大。用胸腔积液凝集物做免疫组织化学染色，可连续切片，有利于多种抗体组合运用或对某一特定细胞的比较观察，阳性颗粒为棕黄色，定位准确可靠、背景清、可重复性高，提高了疑难病例诊断的准确率[4]。

据细胞涂片HE染色对恶性肿瘤及疑似肿瘤和间皮细胞做以下免疫组织化学染色，钙结合蛋白染色，间皮瘤有表达，在间皮瘤与肺腺癌的诊断中具有一定的价值，而腺癌极少表达(9.8%)[7，8]。本研究中1例腺癌细胞蜡块及凝集物蜡块均表达阳性结果。细胞角蛋白(CK)染色可作为上皮源性肿瘤的重要标志物，但不能完全区分腺癌与间皮瘤。波形蛋白(vimentin)染色是间叶源性肿瘤细胞的标志物，因此可用于区分腺癌与间皮瘤[9，10]。肺腺癌免疫组化通常CK7、Napsin A和TTF-1 均呈阳性[11～15]。肺鳞癌免疫组化标记CK、p40、CK5/6、p63均呈阳性[16]。笔者应用一组抗体进行检测比较，不仅提高了诊断的阳性率，而且对腺癌和恶性间皮瘤起到鉴别诊断作用。同时胸腔积液中增生或退变的间皮细胞与某些恶性细胞尤其是腺癌细胞在形态上易于混淆，给诊断带来困难。将免疫组织化学用于良恶性胸腔积液的鉴别诊断，结果直观，较易判断[17～19]。

胸腔积液凝集物制作蜡块的方法简单，与细胞涂片相结合，对于组织脱落细胞良恶性很好鉴别， 使诊断结果准确可靠，防止漏诊、误诊，为临床治疗提供明确依据[20]。胸腔积液凝集物制作成的蜡块，可以提供样本结构性的信息，还可以用作免疫组织化学和特殊染色以及分子检测。所以没有任何理由丢弃胸腔积液中的凝集物，这样可以以最低的代价获得后续辅助研究的理想对象。对于含有悬浮凝集物的胸腔积液标本，完全可以用凝集物替代细胞蜡块的制作。