白藜芦醇对血管平滑肌细胞增殖以及STAT3信号通路的作用

李永光 赵 雨 赵丽杰 周慧轩 刘向东 张庆勇 沈成兴 魏 盟

高血压是一个重要的公共健康问题，它与心血管疾病风险密切相关，可以诱导血管平滑肌细胞增殖及迁移[1]。而血管平滑肌细胞(VSMCs)的增殖在血管变化(包括血管重塑)中起到了重要作用。虽然针对血管平滑肌细胞增殖研究的药物不断进展，但仍是临床上一个主要挑战。在这种情况下，信号转导和转录激活因子(STAT3)得到了不断研究，它是一种潜在的治疗血管平滑肌细胞增殖的药物。在VSMCs中STAT3信号通路的激活促进了VSMCs的增殖[2]。

STAT3，作为STAT 7个家族成员中的一个转录因子，可以受到众多细胞因子，生长因子以及激素调节，其中包括IL-6、表皮生长因子(EGF)和瘦素的调节[3,4]。当受到外界刺激时，STAT3可以通过非酪氨酸激酶受体，如JAK2和Src激活，同时也可以受到Sirt1和其他小分子调控，如细胞因子抑制信号3(SOCS3)调控，然后活化的STAT3形成二聚体，转运到细胞核，并在核内调节靶基因的转录和表达[5]。STAT3参与生理反应和病理的变化，如血管狭窄和动脉壁的增厚，血管平滑肌细胞STAT3受到外界影响因素而激活，从而影响细胞增殖及凋亡，大量的研究证明STAT3具有促增殖功能。其中STAT3在肺动脉高压中活化，另外，凝血酶和IFN-γ通过STAT3信号通路调控平滑肌细胞增殖，同时参与调控平滑肌细胞增殖相关的基因cyclin B1以及存活因子(Bcl-2)表达[5,6]。因此STAT3目前被认为是VSMCs抗增殖的潜在的分子靶点。

白藜芦醇是在葡萄和其他食物中发现的一种多酚类二苯乙烯衍生物，其表现出抑制增殖作用。在肿瘤研究中，白藜芦醇拮抗增殖作用主要是通过抑制STAT3信号通路来起作用[7,8]。除了白藜芦醇在肿瘤中的功能，白藜芦醇具有多种生物学性质，包括拮抗增殖、炎症、细胞肥大以及分化[9]。然而，白藜芦醇在平滑肌中的作用以及和STAT3在其中增殖方面扮演的角色还没有被研究。在本研究中，评估了血管平滑肌细胞中，白藜芦醇的抗增殖作用以及和STAT3信号通路的分子机制。

材料与方法

1.试剂:白藜芦醇和MTT购自美国Sigma公司。抗体STAT3，P-STAT3(Tyr705)购自美国Cell Signaling Technology公司。抗体GAPDH购自美国Santa Cruz Biotechnology公司。 二抗购自Biosynthesis Biotechnology公司。青霉素、链霉素、DMEM以及胎牛血清购自美国Gibco公司。

2.细胞及处理条件：血管平滑肌细胞保持在高浓度葡萄糖(4.5g/L)，L-谷氨酰胺和丙酮酸钠的DMEM/F12中，其中含有10%胎牛血清，100单位/毫升青霉素-链霉素。原代主动脉血管平滑肌细胞通过体外生长方法获得。主动脉从10～12周龄的Wistar大鼠获得。在无菌条件下取出Wista大鼠主动脉降段，用D-Hanks液洗去血污；分离中膜和外膜，并将其平铺于平皿上，用刀切碎成1mm3小块；然后接种于培养瓶中，加入含有20%的胎牛血清的DMEM-F12的培养液，置于37℃恒温箱中；每3天换液1次，待细胞从组织块爬出后，移弃组织块；VSMCs传至第6～10代时用于实验。在处理之前，将细胞血清饥饿24h，并以5×105细胞密度接种于6孔板中。进而研究白藜芦醇对血管平滑肌细胞功能的影响。VSMCs分为实验组和对照组，对照组以无DMSO及白藜芦醇组作为对照。加入白藜芦醇实验浓度，培养24h，然后收集细胞，并利用反转录聚合酶链反应(实时定量PCR)和免疫印迹分析方法途径检测细胞增殖和细胞信号的变化。

3.蛋白免疫印迹:Western blot法免疫印迹分析根据之前的步骤稍作修改[10]。蛋白通过SDS-PAGE分离并转移到硝酸纤维素膜(Novex, 美国Invitrogen公司)，然后利用5%脱脂牛奶，室温封闭1h。待封闭结束以后，膜利用抗体STAT3,P-STAT3 Tyr705 (Tyr705)，和GAPDH(美国Santa Cruz公司)。待孵育结束，利用二抗孵育结合。然后印迹利用增强化学发光检测试剂(美国Thermo Scientific公司)检测，然后条带利用Quantity One软件定量分析(美国BioRad公司)。

4.反转录PCR分析：血管平滑肌细胞利用白藜芦醇(1μmol/L和100μmol/L)处理24h后，提取总RNA。利用TRIzol®试剂(美国Life Technologies公司)，并根据说明书进行提取。RNA利用分光光度计在260nm处进行定量分析，并根据A260/280的比值确定，其纯度通过在变性琼脂糖凝胶中评估。cDNA合成根据制造商的说明书进行。合成cDNA后，PCR反应包括32个循环：95℃，30s，退火温度为56℃ 30s，72℃，30s；最后一个周期在72℃延长5min。最后PCR产物通过电泳在2%的琼脂糖凝胶并通过溴化乙锭染色显现。每个样品重复3次，至少有3个反应用于计算。基因引物序列表参见表1，另外，β-actin作为内参。吸光度用凝胶成像3.74系统检测相对表达。

表1 本研究中使用的寡核苷酸引物序列

F.正向引物；R.反向引物

5.细胞增殖检测:利用MTT方法检测细胞增殖。血管平滑肌细胞以1×104个细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，血清饥饿24h。然后加入白藜芦醇处理24h，再加入含有MTT的磷酸盐缓冲液进去，MTT最终浓度是0.5mg/ml，然后37℃，孵育4h。最后将培养基轻轻吸弃，并每孔中加入DMSO 150μl。然后将板放在摇床上摇晃10min，使产物最终溶解。利用含有DMSO孔作为空白对照，然后利用分光光度计(美国BioTek公司)，测量490nm处的吸光度值。

结 果

MTT法用来检测血管平滑肌细胞增殖能力。在血清饥饿24h后，依据实验条件，利用不同浓度的白藜芦醇(1、100μmol/L)加入平滑肌细胞中进行孵育24h，然后MTT法来检测分析。和对照组比较，白藜芦醇组(100μmol/L)处理可以抑制血管平滑肌细胞增殖(P<0.05，图1)。

为进一步研究白藜芦醇对STAT3信号通路的调控作用，经过不同浓度的白藜芦醇(1、100μmol/L)处理24h后，利用蛋白免疫印迹方法检测STAT3及STAT3-Tyr705磷酸化改变情况，其中STAT3-Tyr705磷酸化参与血管平滑肌细胞增殖。和对照组比较，白藜芦醇(1、100μmol/L)可抑制STAT3-Tyr705磷酸化，其中高浓度白藜芦醇组抑制作用更明显(P<0.05，图2)。

图1 不同浓度白藜芦醇对平滑肌细胞增殖的作用与对照组比较，*P<0.05

图2 白藜芦醇对STAT3信号通路的作用A.不同浓度的白藜芦醇对P-STAT3信号通路的作用；B.STAT3-Tyr705与GAPDH比较；C.STAT3与GAPDH比较；与对照组比较，*P<0.05

同时为进一步了解STAT3-Tyr705相关下游基因的改变情况，对和细胞增殖相关的cyclinB1、Bcl-2进行研究，研究显示经过白藜芦醇处理24h后的血管平滑肌细胞下游基因cyclinB1、Bcl-2实验组较对照组明显下调(P<0.05,图3A)。此外，STAT3相关的基因SOCS3(负反馈抑制STAT3磷酸化)也得到了研究，转录水平研究提示SOCS3在白藜芦醇高浓度处理组 (100μmol/L)较对照组明显升高，而低浓度组差异并无统计学意义(P<0.05,图3B)。

图3 白藜芦醇对STAT3下游信号通路的调控A.下游基因cyclinB1及Bcl-2的作用。利用反转录PCR检测STAT3相关的靶基因cyclinB1和Bcl-2其中β-actin作为内参；B.下游基因SOCS3的作用。显示和STAT3相关的靶基因SOCS3，其中β-actin作为内参，与对照组比较，*P<0.05

讨 论

体外研究证明白藜芦醇抑制血管平滑肌细胞增殖，同时探讨研究其分子机制。白藜芦醇抑制血管平滑肌细胞增殖，同时抑制STAT3的转录活性以及相关靶基因。该研究证明STAT3可能是白藜芦醇的一个靶点。因此本研究结果表明白藜芦醇可能通过抑制STAT3活性来起作用。该研究证明白藜芦醇抑制p-STAT3信号通路，同时抑制VSMCs增殖。

白藜芦醇是一种天然多酚，是植物自然产生的一种抗毒素。白藜芦醇具有多种益处，预防癌症，保护心血管，拮抗炎症以及抗糖尿病作用[11]。而其拮抗增殖活性是通过抑制NF-κB、ER以及Cx43磷酸化来起作用[12,13]。然而白藜芦醇的抗增殖功能不能仅仅从这几个转录因子就解释清楚，其抗增殖作用机制依然需要进一步阐述和证明。在本项研究中白藜芦醇抑制VSMCs增殖。进一步证明了在VSMCs中STAT3是白藜芦醇调控的靶基因。白藜芦醇抑制STAT3磷酸化，可能是通过调控SOCS3的表达来起作用。因此笔者的研究证明，在VSMCs中STAT3是白藜芦醇调控的一个新靶点。

在VSMCs中作用于STAT3活性的因子有很多是通过抑制或者激活STAT3上游信号分子来起作用，如Src、JAK2[14,15]。这些信号分子导致的细胞增殖是通过STAT3下游靶基因来起作用的。STAT3已经证明是一个拮抗增殖的靶点。在该研究中，白藜芦醇可以抑制STAT3磷酸化，同时上调SOCS3，因此在VSMCs中，白藜芦醇抑制STAT3磷酸化以及其下游靶基因，可能是通过上调SOCS3反馈抑制STAT3磷酸化来起作用。该机制在VSMCs中首次发现。另外白藜芦醇和STAT3的关系以及在VSMCs中的作用在心血管疾病中十分重要，因此需要进行更深入研究，从而证明白藜芦醇对STAT3的作用是通过SOCS3反馈调节来起作用。

近年来研究人员对中草药的抗增殖以及抗炎症作用进行了评估，这些药物包括姜黄色素、茶多酚、维生素E以及白藜芦醇[16,17]。天然化合物因为其生长抑制以及在炎症中的作用变得越来越有吸引力。因此研究白藜芦醇在VSMCs中的作用显得越来越重要。近年来研究显示，STAT3在增殖以及细胞活性方面起到了重要作用，包括抗凋亡分子如Bcl-2和survivin。并通过下调相关基因Nox1、Nox4和MCP-1基因，从而调控血管平滑肌细胞增生[18]。因此抑制STAT3活性可以抑制血管平滑肌细胞增殖。然而尽管如此，在血管平滑肌细胞中白藜芦醇对p-STAT3作用尚未被报道。在该研究中，白藜芦醇抑制p-STAT3信号通路同时作用于SOCS3，并伴随着VSMCs细胞增殖抑制。p-STAT3信号通路的机制说明白藜芦醇这种天然化合物是一种有前途的拮抗增殖的试剂。由于白藜芦醇的抑制浓度(100μmol/L)偏高，因此在防治高血压平滑肌细胞增殖中，需要更深入的研究。

总之，体外研究证明白藜芦醇在VSMCs中具有拮抗增殖作用，其活性是部分通过调控STAT3活性以及其相关的靶基因来起作用的。同时研究显示白藜芦醇对STAT3上游调节信号通路作用非常复杂，因此白藜芦醇在VSMCs中的拮抗增殖作用需要开展进一步研究。