柴胡疏肝散对胃肠功能紊乱大鼠胃窦肌层CX43表达的影响

范才波 程阔菊 彭 雷 罗 云

临床和基础研究已证实柴胡疏肝散能显著改善胃肠功能紊乱，主要表现为改善胃肠运动功能，但具体的作用机制尚不明确[1,2]。缝隙连接是具有电信号转导和物质交换功能的细胞连接方式之一，而缝隙连接蛋白是其最基本的结构和功能单位[3]。胃肠神经-cajal间质细胞(interstitial cells of cajal,ICC)-平滑肌细胞通过ICC形成完整的网络结构，并成为胃肠运动的基本功能单元[4,5]。缝隙连接蛋白43(connexin43,CX43)是该网络结构中最重要的缝隙连接蛋白，对胃肠运动的电信号转导和调节起着重要作用，电信号的传播会因为CX43的减少或缺失而受到抑制，从而影响胃肠道的舒缩运动[6]。本研究拟从胃窦肌层CX43的表达变化来探讨柴胡疏肝散改善胃肠功能紊乱的作用及机制，从而为临床应用提供部分科学的理论依据。

材料与方法

1.实验动物:雄性健康SD大鼠(SPF级)，体重230±20g，由成都达硕生物科技有限公司提供，合格证号为SCXK(川2008-24)。

2.主要设备与试剂:柴胡疏肝散各味药材购自达州市中西医结合医院中药房，均附鉴定证书和合格证书，利血平购自天津金耀药业有限公司(批号：1501161)，转录子一期分离试剂(transcriptor first tripure isolation reagent)、LightCycler 480 SYBR Green I Master均购自瑞士Roche公司，一抗：CX43、β-actin(细胞信号转导，Cell Signaling)，荧光二抗、DAPI购自谷歌生物公司,LightCycler480购自瑞士Roche公司，Odyssey扫描成像系统购自美国LI-COR公司，倒置荧光显微镜(Eclipse Ti-SR)购自日本Nikon公司，透射电子显微镜(HT7700)购自日本日立公司，切片机(型号UC7)购自德国Leica公司，钻石切片刀(Daitome,Ultra 45°)。

3.药物制备：柴胡疏肝散[7]汤剂由陈皮、柴胡各120g，川芎、枳壳(麸炒)、芍药各90g，甘草(炙)30g，香附90g组成。药材经清洗后温水1000ml浸泡1h，后煎煮30min，提取2次，再合并水煎液，冰箱中保存备用。

4.模型制备及分组:实验分组:取雄性健康SD大鼠80只，采用随机数字表法分成4组，即空白对照组(对照组)、胃肠功能紊乱模型组(模型组)、对照+药物组、模型+药物组，每组分别为20只。模型制备参考英振昊的方法，按照0.5mg/(kg·d)的剂量连续腹腔注射利血平14天；对照组腹腔注射同等剂量的生理盐水[8]。给药方法：药物组按照每只大鼠30ml/(kg·d)的柴胡疏肝散汤剂剂量，分两次早晚灌服大鼠，于造模同时进行，连续14天，对照组给予等量灭菌注射用水灌胃。

模型制备是否成功的判定方法：(1)胃窦组织免疫组化：胃窦组织于4%多聚甲醛中固定，乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片，HE染色，脱水封片，光学显微镜下观察记录。(2)胃生物电检测：大鼠经戊巴比妥麻醉后仰卧位固定，剑突下腹部正中切口，在胃窦距离幽门0.5cm处的浆膜下安置电极，电极另一端连接BL-420F生物机能实验系统，记录在体慢波并计算其频率、振幅、慢波频率变异系数和慢波振幅变异系数。(3)胃排空实验：禁食36h后给予营养半固体饮食3ml，30min后取胃，称重计量为M1，剪开胃体，清除胃内容物，用滤纸吸干水分称重为M2，计算胃残留率：(M1-M2)/2×100%。

5.实时PCR 检测：待胃运动功能检测结束后，剥离胃窦黏膜，将肌层组织迅速放入经液氮预冷的无酶EP管(预先已放入研磨珠子)中，在研磨器中对组织进行充分粉粹研磨。研磨结束后，向EP管中加入1ml三纯分离试剂(tripure isolation reagent)，然后按照其说明书提取RNA，接着按照第一主选DNA合成试剂盒《Transcriptor First Stand cDNA Synthsis Kit》说明书将RNA 反转成cDNA，然后于LightCycler®480仪器上对CX43进行实时PCR扩增检测，内参为β-actin。建立待测基因的标准曲线和待测样品的Ct值，据此计算出 SQ 值(起始量)，再计算CX43基因的相对表达量：CX43基因的相对表达量=CX43基因的起始量/β-actin基因的起始量。实时PCR引物相关信息详见表1。

表1 CX43、β-actin实时PCR引物相关信息

6.Western blot法检测：胃窦肌层组织的粉粹研磨同上，组织研磨结束后每EP管加入1ml 预冷的RIPA 缓冲裂解液，置冰上用超声裂解仪充分裂解组织，于4℃下12000×g离心30min，收集上清液即为细胞的总蛋白溶解液，对蛋白浓度定量后加入SDS/PAGE煮沸5min变性蛋白，将蛋白转移至NC膜，后续加入CX43、β-actin(大鼠)一抗及相应的二抗。采用Odyssey 扫描成像系统(美国LI-COR公司)对蛋白进行定量分析。

7.免疫荧光检测：剥离大鼠胃窦肌层，经丙酮固定→常规乙醇逐级脱水→二甲苯透明→石蜡包埋→切片→脱蜡→抗原修复→画圈自发荧光淬灭→血清封闭→加一抗→加二抗→DAPI复染细胞核→荧光淬灭剂封片，于倒置荧光显微镜下观察并采集图像。

8.电镜检测：取大鼠胃窦肌层不超过1mm×1mm×1mm组织，迅速投入电镜固定液4℃中固定2～4h，0.1mol/L PBS漂洗，再用1%的锇酸室温固定2h，0.1mol/L PBS漂洗，不同浓度的乙醇-丙酮梯度脱水，经丙酮渗透、树脂聚合、60～80nm超薄切片，铀铅双染色后置透射电镜下观察。

结 果

1.模型制备:造模结束后模型组大鼠胃窦组织病理学表现为无器质性病变(图1)；胃运动功能表现为慢波频率及振幅下降(生物电检测,P<0.05)、胃排空减慢(胃残留率增多,P<0.05,表2)，根据模型组大鼠的胃组织病理学及运动功能表现，可判定模型制作成功。

图1 大鼠胃肠功能紊乱动物模型胃和结肠的组织病理学表现(HE染色，×200)A.对照组；B.对照+药物组；C.模型组；D.模型+药物组

表2 大鼠胃肠功能紊乱动物模型胃运动功能检测

与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

2.柴胡疏肝散对胃肠功能紊乱大鼠胃窦肌层CX43 mRNA表达量的影响:模型组大鼠胃窦肌层CX43的mRNA表达量显著减少(P<0.05)；柴胡疏肝散对正常大鼠胃窦肌层CX43 mRNA表达量无影响(P>0.05)，但可显著上调胃肠功能紊乱大鼠胃窦肌层CX43 mRNA表达量(P<0.05)，详见图2。

3.柴胡疏肝散对胃肠功能紊乱大鼠胃窦肌层CX43蛋白表达的影响:模型组大鼠胃窦肌层CX43的蛋白表达量显著减少(P<0.05)；柴胡疏肝散对正常大鼠胃窦肌层CX43 的蛋白表达量无影响(P>0.05)；但可显著上调胃肠功能紊乱大鼠胃窦肌层CX43 的蛋白表达量(P<0.05)，详见图3。

图2 柴胡疏肝散对胃肠功能紊乱大鼠胃窦肌层CX43 mRNA表达的影响与对照组比较,*P<0.05；与模型组比较,#P<0.05

图3 柴胡疏肝散对胃肠功能紊乱大鼠胃窦肌层CX43蛋白表达的影响与对照组比较,*P<0.05；与模型组比较,#P<0.05

4.柴胡疏肝散对胃肠功能紊乱大鼠胃窦肌层CX43 免疫荧光的影响:荧光显微镜下观察，正常大鼠(对照组)胃窦肌层内可见均匀的CX43阳性表达；对照+药物组与对照组类似；模型组CX43阳性表达显著减少；模型+药物组中CX43阳性表达较模型组显著增多,详见图4。

图4 柴胡疏肝散对胃肠功能紊乱大鼠胃窦肌层CX43免疫荧光的影响(×400)A.对照组；B.对照+药物组；C.模型组；D.模型+药物组

5.柴胡疏肝散对胃肠功能紊乱大鼠胃窦肌层CX43透射电镜的影响：透射电镜下观察，正常大鼠(对照组)胃窦肌层内肠神经-ICCs-平滑肌网络中肠神经与ICCs、ICCs相互之间、ICCs与平滑肌细胞以及平滑肌细胞相互之间存在完整的缝隙连接；对照+药物组与对照组类似；模型组胃窦肌层内肠神经-ICCs-平滑肌网络结构存在较大缝隙，较少发现有缝隙连接；模型+药物组肠神经-ICCs-平滑肌网络结构之间的连接基本保持完整,详见图5。

图5 柴胡疏肝散对胃肠功能紊乱大鼠胃窦肌层CX43 透射电镜的影响(5μm)A.对照组；B.对照+药物组；C.模型组；D.模型+药物组

讨 论

胃肠功能紊乱是临床上常见的非器质性功能性胃肠道疾病，以胃肠道运动功能障碍为主，临床上表现为无器质性病变的腹痛、腹泻、便秘等消化系统症状，发生率约为40%，约占胃肠道疾病的40%～60%，并呈逐年上升的趋势[9，10]。其发病机制复杂，临床上缺乏有效的化学药物。临床和基础研究显示柴胡疏肝散能显著改善胃肠功能紊乱症状，但其具体的作用机制尚不明确[2,11]。随着我国传统医学在全球范围逐步得到认同，更多的国外研究者要求我国的传统医学能提供现代的科学理论依据。

正常的胃肠运动功能源于正常的胃肠蠕动，而正常的胃肠蠕动依赖于规律的慢波电位，研究证实肠肌间神经丛ICC (myentericICC,ICC-MY)是胃肠道内慢波电位的起博者，以突触小体的方式将慢波电位传递给与肌内 ICC(intramuscular ICC，ICC-IM)和深肌层丛ICC(deep muscular plexus ICC,ICC-DMP)[12]。ICC-IM、ICC-DMP以缝隙连接的方式将慢波电位传递给平滑肌细胞，最终由平滑肌细胞执行胃肠道的舒缩功能[13]。ICC同样以突出小体的形式与胃肠道自主神经和肠神经系统相连，将其兴奋性或抑制性信号传递给平滑肌，从而起到调节胃肠道平滑肌收缩的作用[14]。因此，胃肠神经-ICC-平滑肌细胞通过ICC形成完整的网络结构，并成为胃肠运动的基本功能单元。

缝隙连接蛋白43(connexin43,CX43)是ICC与平滑肌细胞及平滑肌与平滑肌细胞间最重要的缝隙连接蛋白，因此对胃肠运动的电信号转导和平滑肌细胞的收缩起着重要作用[15]。电信号的转导会因为CX43的减少或缺失而受到抑制，从而影响胃肠道的舒缩运动。如张国山[16]报道在功能性消化不良的大鼠模型中，模型大鼠胃肠道内的CX43表达显著减少。吴全霞等[17]研究证实在糖尿病胃轻瘫的大鼠模型中，胃窦肌层中的CX43表达显著减少或缺失，证实在胃肠运动功能障碍中，胃肠道内CX43的表达量会减少或缺失，也可以从另一方面说明可能正是由于CX43的减少或缺失导致慢波电位不能顺利地从ICC-IM、ICC-DMP传播到平滑肌细胞以及在平滑肌细胞间的传播，进而导致胃肠道的舒缩障碍。因此，通过上调胃肠道肌层内CX43的表达而调解慢波电位在胃肠道平滑肌细胞间的传播，将有效的治疗由胃肠道舒缩障碍导致的胃肠功能紊乱。

本研究利用腹腔注射利血平成功制备胃肠功能紊乱大鼠模型，胃运动功能表现为慢波频率及振幅下降、胃排空减慢，利用实时PCR、Western blot、组织免疫荧光技术显示在模型组大鼠的胃窦肌层中CX43的表达显著减少，同时透射电镜观察到ICC与平滑肌细胞以及平滑肌与平滑肌细胞间的缝隙连接显著减少，细胞间的间隙显著变大，再次证明了在胃肠运动功能障碍中，会伴随着CX43的减少或缺失。应用柴胡疏肝散干预后，胃窦肌层CX43表达显著增多，ICC与平滑肌细胞以及平滑肌与平滑肌细胞间的缝隙连接增多，细胞间的间隙显著变小，整体动物实验表现为胃运动功能得到显著改善，表明柴胡疏肝散能通过CX43的表达增加ICC与平滑肌细胞以及平滑肌与平滑肌细胞间的缝隙连接，调解慢波电位从ICC-IM、ICC-DMP到平滑肌细胞以及在平滑肌细胞间的传播，从而改善胃肠蠕动。

综上所述，柴胡疏肝散可通过上调胃窦肌层内CX43的表达而促进慢波电位的传播，从而改善胃肠功能紊乱，但其具体调解机制包括对胃肠激素等的影响等尚需进一步研究。