藏红花素对糖尿病大鼠胰腺组织保护作用的研究

王立哲 王振贤 马晓伟

胰腺功能降低、胰岛素分泌相对不足是糖尿病及其并发症的病理根源[1]。因此，降低糖尿病患者胰腺损伤、改善胰腺组织功能或许是研究新型抗糖尿病药物的有效途径。藏红花素(crocin)是在番红花中发现的一种水溶性化合物，具有良好的抗氧化作用和抗炎作用[2～4]。既往研究发现藏红花素具有改善糖尿病大鼠胸主动脉环舒缩功能、抑制视网膜微血管内皮损伤的作用[5,6]。王素莲等[7]研究发现藏红花素具有降低血脂的药理学作用。本研究采用链脲佐菌素(STZ)连续3天腹腔注射30mg/(kg·d)的方法制备实验性2型糖尿病大鼠模型，研究藏红花素对2型糖尿病大鼠睾丸组织并发症的抑制作用及其可能的作用机制。

材料与方法

1.实验动物:清洁级健康雄性SD大鼠120只,7周龄、体质量210～250g，购自河北省实验动物中心，实验动物许可证号：SCXK(冀)2013-1-003。饲养环境：恒温、恒湿(23～25℃、相对湿度65%～70%)，光照周期12h∶12h。适应性饲养1周后进行实验。

2.药物、试剂与仪器:藏红花素(美国Sigma公司，纯度≥99.9%，批号：E170411b)；盐酸二甲双胍片(中美上海施贵宝制药有限公司，规格：0.5g，批号：20170618)；超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)、糖化血红蛋白(GHb)测试试剂盒(南京建成生物工程研究所)；胰岛素测定试剂盒(美国密理博公司)；STZ(美国Sigma公司)。UV-1206型紫外分光光度计(日本SHIMODZU公司)；BS-390全自动生化分析仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)；血糖仪(瑞士罗氏公司)；iMark型酶标仪(美国 Bio-Rad公司)。

3.分组、模型制备与给药：120只实验用SD大鼠按照体质量随机分为正常组、模型对照组、藏红花素25、50、100mg/(kg·d)组和二甲双胍25mg/(kg·d)组，各组均20只。采用STZ连续3天腹腔注射30mg/(kg·d)的方法制备实验性2型糖尿病大鼠模型，以空腹血糖水平持续高于16.7mmol/L认定为造模成功。称取适量藏红花素，0.9%NaCl注射液溶解并配置浓度为50.0、25.0、12.5mg/ml的藏红花素溶液，同样的方法配置浓度为12.5mg/ml的二甲双胍，按2ml/kg给药，1次/天，正常对照组和模型组均同步给予等剂量的0.9% NaCl(2ml/kg)，疗程12周。

4.空腹血糖(FBG)、空腹胰岛素(FINS)、糖化血红蛋白(GHb)的测定及胰岛素敏感指数(insulin sensitivity index，ISI)、胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)的计算：分别于给药后第0、4、8、12周，通过尾静脉空腹采血，通过血糖仪测定FBG，并按试剂盒测定FINS水平和GHb水平。参照Li等[8]报道的方法计算胰岛素敏感指数：ISI=Ln [1/(FINS× FBG)]；参照Hanley等[9]报道的方法计算胰岛素抵抗指数：HOMA-IR=(FBG×FINS)/22.5。

5.胰腺组织病变及细胞凋亡的观察：每组随机取10只大鼠，麻醉后开腹取胰腺组织，置10%甲醛溶液中进行固定，然后依次行石蜡包埋、切片、展片，然后通过常规HE染色进行胰腺组织病理学检查；取石蜡切片，根据试剂盒说明进行TUNEL染色，通过倒置光学显微镜下观察胰岛细胞凋亡(细胞核黄染为阳性着色)；计算凋亡指数(AI)：AI(%)=凋亡细胞数/胰岛总细胞数×100%，每张切片分别取5个视野，分别进行计数和计算，然后取平均值。

6.抗氧化酶活性和MDA含量的测定：取每组剩余的10只大鼠，麻醉后开腹取胰腺组织，研磨匀浆后低温离心(4℃，3000r/min)离心10min取上清液，然后通过紫外分光光度计测定超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性和MDA含量。

结 果

1.各组大鼠FBG、FINS及GHb水平测定结果:糖尿病模型对照组大鼠FBG水平、GHb水平较正常组大鼠均显著升高(P<0.01)，FINS水平显著降低(P<0.01)。经藏红花素50～100mg/(kg·d)治疗12周能够显著降低糖尿病大鼠FBG水平并提高FINS水平(P<0.05)，并且藏红花素100mg/(kg·d)组GHb水平显著降低(P<0.05)。与二甲双胍25mg/(kg·d)组比较，藏红花素100mg/(kg·d)组FINS水平显著升高且GHb水平显著降低(P<0.05)，详见表1。

表1 各组大鼠FBG、FINS及GHb水平

与正常组比较，*P<0.01；与模型对照组比较,#P<0.05,##P<0.01；与二甲双胍25mg/(kg·d)组比较,ΔP<0.05

2.各组大鼠ISI和HOMA-IR测定结果:糖尿病模型对照组大鼠ISI、HOMA-IR较正常组大鼠显著升高(P<0.01)。经藏红花素50～100mg/(kg·d)治疗12周能够显著降低糖尿病大鼠ISI、HOMA-IR(P<0.05)。与二甲双胍25mg/(kg·d)组比较，藏红花素100mg/(kg·d)组HOMA-IR显著降低(P<0.05),详见表2。

3.各组大鼠胰腺组织病理学检查结果:与正常组比较，糖尿病模型对照组大鼠胰腺组织呈现明显的病理异常，主要表现为胰岛萎缩、胰岛细胞数量减少且分布稀疏、排列紊乱等；经藏红花素或二甲双胍治疗12周能够不同程度改善糖尿病大鼠胰岛组织病变，组间比较，以藏红花素100mg/(kg·d)组效果最为显著，详见图1。

表2 各组大鼠ISI和

与正常组比较,*P<0.01；与模型对照组比较，#P<0.05,##P<0.01；与二甲双胍25mg/(kg·d)组比较,ΔP<0.05

图1 各组大鼠胰腺组织病理学检查结果(HE，×200)A.正常组；B.模型对照组；C.藏红花素25mg/(kg·d)组；D.藏红花素50mg/(kg·d)组；E.藏红花素100mg/(kg·d)组；F.二甲双胍25mg/(kg·d)组

4.各组大鼠胰腺组织细胞凋亡状况:与正常组比较，糖尿病模型对照组大鼠胰腺组织凋亡细胞数量明显增多，而经藏红花素或二甲双胍治疗12周能够不同程度减少糖尿病大鼠胰腺组织凋亡细胞数量，组间比较，以藏红花素100mg/(kg·d)组效果最为显著。计算各组大鼠胰腺组织细胞AI，正常组AI为2.17%±0.41%，糖尿病模型对照组AI为30.15%±4.09%，藏红花素25mg/(kg·d)、50mg/(kg·d)、100mg/(kg·d)组AI分别为28.47%±3.50%、23.46%±2.68%、16.62%±2.31%，二甲双胍25mg/(kg·d)组AI为29.53%±2.97%；糖尿病模型对照组AI较正常组显著升高(P<0.01)，经藏红花素50～100mg/(kg·d)或二甲双胍25mg/(kg·d)治疗12周能够显著降低糖尿病大鼠胰腺组织细胞AI(P<0.05)；与二甲双胍25mg/(kg·d)组比较，藏红花素100mg/(kg·d)组AI显著降低(P<0.01)，详见图2。

图2 各组大鼠胰腺组织细胞凋亡状况(TUNEL，×400)A.正常组；B.模型对照组；C.藏红花素25mg/(kg·d)组；D.藏红花素50mg/(kg·d)组；E.藏红花素100mg/(kg·d)组；F.二甲双胍25mg/(kg·d)组

5.各组大鼠胰腺组织抗氧化酶活性和MDA含量测定结果:糖尿病模型对照组大鼠胰腺组织SOD、CAT活性较正常组显著降低且MDA含量显著升高(P<0.01)。经藏红花素50～100mg/(kg·d)治疗12周能够显著提高糖尿病大鼠胰腺组织SOD、CAT活性并降低MDA含量(P<0.05)。与二甲双胍25mg/(kg·d)组比较，藏红花素100mg/(kg·d)组SOD活性显著升高且MDA含量显著降低(P<0.05)，详见表3。

讨 论

糖尿病已经发展成为世界三大疑难疾病之一，目前，世界上约4亿人患糖尿病，并且呈逐年增多的趋势；而我国有近1亿糖尿病患者，是世界上糖尿病发生率最高的国家[10～12]。病理生理学研究认为，胰岛β细胞功能减弱或丧失，导致胰岛素分泌相对不足或绝对不足是导致糖尿病的根本机制，因此保护胰腺组织或许是治疗糖尿病的有效途径[13，14]。

表3 各组大鼠胰腺组织抗氧化酶活性和MDA含量

与正常组比较,*P<0.01；与模型对照组比较,#P<0.05,##P<0.01；与二甲双胍25mg/(kg·d)组比较,ΔP<0.05

正常的胰岛结构是维持胰岛正常生理学功能的基础，在糖尿病的不同发展阶段，胰腺的组织形态都会出现相应的改变，这种改变是胰岛功能障碍的基础[15]。本研究发现经藏红花素干预能够抑制糖尿病大鼠胰岛萎缩、胰岛细胞数量减少、排列紊乱等形态结构改变，抑制胰岛细胞凋亡，并且藏红花素100mg/(kg·d)组优于二甲双胍25mg/(kg·d)组，提示藏红花素具有抑制2型糖尿病大鼠胰岛组织病变的作用。

胰岛β细胞功能受损是2型糖尿病的重要特征，空腹胰岛素(FINS)降低和糖化血红蛋白(GHb)水平降低而空腹血糖(FBG)水平升高是其主要的临床表现[16]。本研究发现，藏红花素能够有效降低糖尿病大鼠FBG、GHb水平并提高FINS水平，降低糖尿病大鼠ISI、HOMA-IR，并且藏红花素100mg/(kg·d)组上述效应优于藏红花素50、25mg/(kg·d)组和二甲双胍25mg/(kg·d)组。提示藏红花素具有改善2型糖尿病大鼠胰岛β细胞功能的作用。

胰岛组织氧化应激损伤是其主要的病理机制之一，体内氧自由基代谢失衡是氧化应激损伤的病理基础，SOD、CAT是体内清楚氧自由基的关键还原酶[17～21]。MDA为脂质过氧化反应终产物，因此胰腺组织SOD、CAT活性和MDA含量能够间接反应胰腺组织氧化应激损伤的程度[22，23]。本研究发现，经藏红花素治疗能够有效改善抗氧化酶(SOD、CAT)活性并降低MDA含量，并且藏红花素100mg/(kg·d)组改善SOD活性及降低MDA含量作用优于藏红花素50、25mg/(kg·d)组和二甲双胍25mg/(kg·d)组，提示藏红花素具有抑制糖尿病大鼠胰腺组织氧化应激损伤的作用。

综上所述，藏红花素对2型糖尿病大鼠胰腺组织损伤具有一定的保护作用，其机制可能与抑制氧化应激损伤有关。