HNF1A、HNF1B、C/EBPA和ZHX2基因多态性与血清AFP水平相关性研究

李雪君 邵冬华 何美琳 梁国威

甲胎蛋白(AFP)是目前原发性肝癌广泛使用的肿瘤标志物[1]。然而仅有60%的肝癌患者在初诊时血清AFP水平升高，其不升高原因未明。研究显示，转录水平调控是AFP基因表达的限速步骤[2]。AFP基因转录调控包括启动子，3个独立增强子和2个沉默子[3]。在遗传性持续高AFP血症(HPAFP)家族中的研究显示，AFP基因启动子上2个肝细胞核因子1A(HNF1A)结合位点的点突变是非疾病性高AFP血症的原因[4]。然而，是否HNF1A或其他AFP表达调控因子基因突变也与血清AFP水平相关，目前未见文献报道。

笔者选择AFP基因启动子表达的关键调节因子HNF1A、肝细胞核因子1B(HNF1B)和CCAAT/增强子结合蛋白A(C/EBPA)基因，以及沉默子区调控因子锌指和同源框蛋白2(ZHX2)基因作为研究靶点，优先选择最小等位基因频率(MAF)>5%的外显子错义突变(1000基因组数据库)，或者已经有研究表明与某些性状或疾病相关的SNP位点作为研究对象，在1010例中国汉族健康成人中，探讨HNF1A-rs1169288(A/C，Ile27Leu)和rs2464196(G/A，Ser487Asn)、HNF1B-rs4430796(A/G)、C/EBPA-rs34529039(C/A)和ZHX2-rs7844465(G/T)与血清AFP水平相关性[3～5]。

对象与方法

1.研究对象:2017年1～11月在笔者医院招募了1010例年龄在25～65岁的健康汉族受试者，其中男性615例，女性395例。符合以下任意标准的受试者被剔除：急性或慢性病毒性肝炎感染[乙型肝炎病毒表面抗原和(或)丙型肝炎病毒抗体检测阳性]，男性饮酒量≥140克/周或女性≥70克/周，妊娠，肝癌和其他恶性肿瘤。从每个受试者获得书面知情同意书。整个研究符合赫尔辛基宣言并获得笔者医院伦理学委员会批准。

2.方法：记录并测量所有受试者的年龄、性别、身高、体重，并计算体重指数(BMI)。收缩压和舒张压取3次静息水平测量的平均值。

采用美国Philips公司(IU-22型)B型超声影像仪行腹部B型超声来诊断脂肪肝[6]。

采集空腹静脉血，4h检测完毕。使用AU 2700自动化学分析仪(日本Olympus公司)测量丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、γ-谷氨酰转移酶(GGT)、空腹血糖(FPG)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)。 通过免疫比浊法测定(美国Dade Behring公司)CRP水平。 血清AFP水平通过美国雅培公司i2000免疫分析仪测定，其批内和批间变异系数(CV)分别为3.5%～4.7%和4.1%～8.1%。由美国雅培公司提供配套试剂、标准品和质控品。

3.外周血基因组DNA提取：按照制造商的标准操作步骤，使用DNA分离试剂盒(中国天根生化科技有限公司)从EDTA抗凝保存的200μl全血样品中提取基因组DNA。 提取后的基因组DNA立即在-80℃保存。

4.SNP位点选择及分型：SNP位点选择标准：优先选择最小等位基因频率(MAF)>5%的外显子错义突变(1000基因组数据库)，或者已经有研究表明与某些性状或疾病相关。共挑选了5个SNP作为研究目标，包括HNF1A-rs2464196、rs1169288、HNF1B-rs4430796、C/EBPA-rs34529039和ZHX2-rs7844465(表1)。

采用等位基因特异性引物结合TaqMan探针的荧光定量PCR的方法学(ARMS-TaqMan法)进行检测[7]。根据ΔCt值(ΔCt=野生型等位基因反应的Ct值减去突变型等位基因反应的Ct值)进行分型。PCR试剂使用Tiangen Real Master Mix(Probe)试剂盒(中国天根生化科技有限公司)。使用Primer Premier 5.0软件(加拿大Premier公司)设计引物和探针，并由北京赛百盛基因技术有限公司合成。在所有等位基因特异性引物3′末端-2位置设计一个额外的错配，以加强等位基因特异性区分。使用ABI 7500荧光定量PCR仪(美国ABI公司)进行检测。反应体系为20μl，每种成分的体积(终浓度)如下：上、下游引物各1μl(0.25μmol/L)，TaqMan探针1μl(0.25μmol/L)，2×real-master mix 8μl，增强溶液1μl，ddH2O 6μl，DNA模板2μl。除rs34529039外，所有其他反应的条件均为95℃ 2min，95℃ 15s，60℃ 1min，40个循环。 Rs34529039的反应条件为97℃ 2min，97℃ 15s， 62℃ 1min，50个循环。在1010例受试者中，这5个SNP位点的基因分型成功率均为100%。为了验证基因分型的准确性，笔者通过直接测序(中国赛百盛基因技术有限公司)对30个随机样品进行重新测定，两个测试结果之间一致性达到100%。

表1 SNP位点ARMS-TaqMan分型法的引物和探针

引物3′端的下划线斜体碱基是错配碱基，以增加等位基因鉴别的特异性

结 果

1.1010例研究对象的基础资料及SNP位点分布频率:在1010例健康汉族受试者中，男性和女性之间年龄、LDL-C以及AFP水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。男性BMI、收缩压、舒张压、AST、ALT、GGT、TG、CRP、FPG以及脂肪肝水平均显著高于女性(P<0.05)，而HDL-C和TC水平显著低于女性(P<0.05)。

基于每个SNP位点的基因型分别将1010例研究受试者分为3组(表2)。 在所有受试者中，rs2464196-A、rs1169288-C、rs4430796-G、rs34529039-A和rs7844465-T的最小等位基因频率分别为0.479、0.453、0.292、0.007和0.199。男性和女性之间各SNP的等位基因频率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。 所有5个SNP位点的等位基因频率在总体或不同性别组中均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)。

P值代表男性、女性性别组间比较

2.不同SNP位点基因型血清AFP水平的变化:如图1所示，HNF1A-rs2464196 GG、GA和AA基因型之间血清AFP水平比较，差异有统计学意义(P=0.000)。rs2464196-AA基因型的平均血清AFP水平为3.60±1.59ng/ml(最低)，AG型为3.92±1.78ng/ml(中间)，GG型为4.21±2.10ng/ml(最高)。3组间比较差异有统计学意义(P值为0.000～0.042)。与rs2464196-GG基因型比较，携带AA和GA+AA基因型的平均血清AFP水平分别下降了14.5%(P=0.000)和9.5%(P=0.001)。HNF1A-rs1169288、HNF1B-rs4430796、C/EBPA-rs34529039和ZHX2-rs7844465与血清AFP水平之间比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

图1 5个SNP位点各基因型血清AFP水平比较误差条形图表示根据SNP位点基因型分层的血清AFP水平，P值为AFP水平进行对数转换后进行组间比较

3.rs2464196等位基因型与血清AFP水平的相关性分析:如表3所示，以AFP水平作为因变量，不同模型的线性回归分析显示，在无协变量(模型1，P=0.000)，或调整年龄、性别和BMI(模型2，P=0.000)，或调整年龄、性别、BMI、血压、LDL-C、HDL-C、TC、AST、lnALT、lnTG、lnGGT、lnCRP、FPG和脂肪肝的情况下， 均显示HNF1A-rs2464196等位基因是血清AFP水平变化的独立影响因素(模型3，P=0.000)。

表3 rs2464196等位基因型与血清AFP水平的相关性

模型1.无协变量；模型2.控制年龄、性别和BMI；模型3.控制年龄、性别、BMI、血压、LDL-C、HDL-C、TC、AST、lnALT、lnTG、lnGGT、lnCRP、FPG和脂肪肝

讨 论

本研究首次探讨了AFP基因转录相关因子常见SNP与血清AFP水平的相关性。 研究结果显示，HNF1A-rs2464196基因多态性与中国汉族健康成人的血清AFP水平密切相关，这种相关性不受年龄、性别、BMI、血压、血脂指标、肝功指标、炎性指标以及脂肪肝的影响。携带rs2464196-A等位基因的个体可能使它们更倾向于表现为低AFP水平。与携带GG等位基因型的人群AFP水平比较，携带rs2464196-AA等位基因型者的AFP水平降低了14.5%，GA+AA型携带者降低了9.5%。另外，HNF1A-rs1169288、HNF1B-rs4430796、C/EBPA-rs34529039和ZHX2-rs7844465与血清AFP水平比较，差异无统计学意义。

HNF1A位于染色体12q24.31上，主要在肝脏中表达，已经在100多种基因的启动子区域发现了HNF1A潜在的结合位点[8]。HNF1A在AFP基因表达的调控中起关键作用。基础研究显示AFP基因启动子上远端HNF1A结合区的点突变可以使AFP表达活性降低约65%，而近端HNF1A结合区点突变可以降低50% AFP表达活性[9]。有研究报道HNF1A基因突变与CRP、LDL-C、HDL-C以及妊娠期糖尿病相关[10～12]。

HNF1A由631个氨基酸组成，包含3个功能结构域：①二聚体结构域(氨基酸1～33);②DNA结合结构域，包含特异性DNA识别所需的区域(氨基酸100～184)和同源结构域(氨基酸198～281);③反式激活结构域(氨基酸282～631)[13]。rs1169288基因多态性位于HNF1A的二聚体结构域，这个区域对于DNA的结合是必需的。因此笔者推测rs1169288基因多态性可能会影响HNF1A蛋白结合AFP基因的能力，从而影响AFP基因表达。然而，笔者的结果显示rs1169288基因多态性与血清AFP水平无显著相关。rs2464196位于HNF1A的反式激活结构域，即rs2464196突变可能影响与AFP基因表达相关的反式调节作用。笔者的结果显示rs2464196多态性与血清AFP水平显著相关，表明rs2464196基因多态性是健康人血清AFP水平的独立遗传决定因素。rs2464196多态性与血清AFP基因表达的确切调控机制有待于进一步研究。

HNF1B基因位于染色体17q12上，编码一种包含3个结构域的POU转录因子：二聚体结构域、POU DNA结合结构域以及反式激活结构域[14]。HNF1B同源二聚体或与HNF1A组成的异源二聚体在脊椎动物早期的发育和存活过程中起着关键作用[15]。研究表明，在肝脏发育过程中HNF1B早于HNF1A产生，是AFP基因启动子强有力的激活剂。在成年人中，HNF1B的高表达与血清AFP水平显著相关。在原发浆液性上皮性卵巢癌中的研究显示与rs4430796高度连锁不平衡的rs757210与HNF1B启动子的低甲基化有关，可导致HNF1B表达增加[16]。笔者的研究表明rs4430796与血清AFP水平无关。然而，应该注意的是，虽然rs4430796不同基因型间AFP水平比较，差异无统计学意义，但是rs4430796-AA、AG和GG基因型的AFP水平呈上升趋势。考虑到本研究中AA基型人群数量明显少于GG型(70例 vs 491例)，因此rs4430796与血清AFP水平的相关性仍需增加样本量来进一步验证。

C/EBPA基因是位于染色体19q13.11上的无内含子基因，通过与AFP基因启动子和增强子的结合反式激活AFP基因表达[17]。直接点突变分析显示，在缺乏增强子Ⅰ的情况下，AFP基因Ⅰb(C/EBP)和Ⅱ(核因子1或C/EBP)区域的突变会显著降低AFP基因启动子活性，而Vb(C/EBP)区域突变对AFP基因启动子有轻微的抑制作用[9]。少量研究表明C/EBPA基因多态性(rs34529039)与卵巢癌相关[18]。但迄今为止，还没有研究表明C/EBPA基因多态性是否与血清AFP水平相关。根据ExAC或1000 Genomes数据库，rs34529039-A的最小等位基因频率分别为0.2143/39和0.1328/665。但在笔者的研究结果中，中国健康成人rs34529039-A的最小等位基因频率仅为0.007/1010。这表明该SNP位点的等位基因频率在不同种族人群中差异有统计学意义。本研究由于A等位基因频率太低，笔者无法得出明确的结论。

ZHX2位于15号染色体上，参与出生后AFP基因的表达调控。研究表明，ZHX2可能通过影响AFP基因转录的稳定性或转录过程来控制成人肝脏中AFP基因的低表达水平，即ZHX2基因的表达产物是AFP基因表达的负性调控因子，但这种调控作用主要发生在正常肝脏中[5]。有研究报道ZHX2基因多态性(rs7844465)与内膜中层厚度相关[19]。笔者的研究表明rs7844465与血清AFP水平无关。

本研究存在一定的局限性。首先，样本量不够大，未检测到某些基因型，例如rs34529039-AA基因型，这可能导致统计效力的降低。因此，笔者的研究应被视为初步揭示血清AFP水平与HNF1A、HNF1B、C/EBPA和ZHX2基因多态性相关性的研究。其次，笔者的研究结果来自于中国汉族人群，需要进一步在不同种族中进一步研究。最后，笔者研究的是健康人群，考虑到约40%的HCC患者血清AFP水平不升高，还应在HCC患者中做进一步验证。因此，还需要更大规模更深层次的综合性研究来证实基因多态性与血清AFP水平的相关性。

综上所述，本研究在中国汉族健康人群中发现HNF1A-rs2464196与血清AFP水平显著相关，rs2464196-A等位基因携带者更倾向于表现为低水平AFP。而HNF1A-rs1169288、HNF1B-rs4430796、C/EBPA-rs34529039和ZHX2-rs4430796与血清AFP水平无显著相关。这一发现为AFP的遗传决定因素提供了新的见解，并可能帮助进一步了解某些HCC患者中AFP水平不升高的潜在机制。