Hedgehog通路介导HL60细胞生物学功能的影响分析

苗玉迪 李艳春 李庆瑞

白血病是常见的血液系统恶性肿瘤之一，其中急性髓细胞白血病(acute myelogenous leukemia,AML)是发生率最常见的白血病类型，约占所有白血病的60%[1，2]。目前针对AML的治疗主要是应用化疗药物与放射治疗，促进白血病患者缓解率增加、病死率降低，但是很多患者由于对化疗药的耐受，导致治疗失败[3，4]。难治性AML是用标准的诱导缓解方案治疗2个疗程未达完全缓解者，也包括多次复发者，这类患者对于放射线和化疗药物具有较强抵抗性，对于治疗的要求更高[5]。

目前难治性AML的发病机制还不明确，被认为是多种因素共同作用的结果[6]。现代研究表明，多条信号通路交互作用是肿瘤发生、发展的一个重要过程，可涉及多条信号通路的调控[7]。Hedgehog通路可参与血管生成、干细胞分化、胚胎发育、器官成熟，其异常活化与多种肿瘤发生相关，包括前列腺癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、甲状腺癌、膀胱癌等[8]。Hedgehog通路中的SHh、DHh、IHh 3个配体可与效应细胞表面的Patched(PTCH)蛋白结合，促进信号的转导并激活下游一系列因子的过程[9]。当前研究表明Hedgehog通路可存在于骨髓基质细胞，Sonic Hedgehog(SHH)信号通路可参与骨髓基质细胞向神经细胞分化过程中，但是可被Hedgehog通路抑制剂Cyclopamine抑制[10]。生物信息学表明Hedgehog通路在难治性AML细胞中表达显著高于非难治性急性白血病，可能在难治性AML治疗反应中具有重要作用[11]。本研究具体探讨了Hedgehog通路介导难治性AML生物学功能的影响，以分析Hedgehog通路具有介导白血病细胞治疗耐药性与放射抵抗的作用机制。现总结报道如下。

材料与方法

1.研究材料:人多药耐药的白血病HL60/ADR细胞株购自中国医学科学院基础医学研究所，放射抵抗的HL60/RX细胞株由购自上海生化研究所。都在在37℃、5%CO2无菌培养箱中培养，培养液为含10%的胎牛血清的DEMD。每2～3天进行传代或者换液培养，选取生长状态良好、处于对数生长期的细胞用于实验。Hedgehog通路抑制剂GANT-61均购自德国Merck公司，DMSO溶解至保存浓度保存。

2.细胞分组:设置GANT-61的浓度依次为0、10、50、100μmol/L，细胞株按孵育时间的不同分为24、48h。每个实验组内均采用110、50、100μmol/L浓度处理细胞，每个浓度设3个复孔。

3.CCK-8检测细胞增殖活性：将96孔板中处理组及对照组细胞约1×106铺入各孔，将培养体系调整为100μl培养24、48h后向每孔加入10μl CCK-8溶液在37℃培养箱中孵育1h后，测定吸光光度值，酶标仪波长调至450nm。

4.流式细胞术检测细胞凋亡：取待测细胞5×105个，PBS洗涤离心，加入500μl Binding Buffer、5μl Annexin Ⅴ和5μl PI，30min后用流式细胞仪检测。

5.克隆形成检测细胞存活:取对数生长期细胞，使用甲基纤维素半固体培养基培养，采用不同浓度GANT-61处理后，在培养24、48h后使用倒置显微镜观察克隆形成情况，克隆形成率(%)=(集落形成个数/接种细胞数)×100%。

6.Western blot法检测细胞表达:吸取待测细胞约5×106个左右，离心后取细胞，采用细胞裂解液进行裂解，采用BCA法测量蛋白浓度，按照40μg上样每孔，按照Western blot法测定GAPDH、pAKT、AKT、NF-κB蛋白表达水平。

结 果

1.细胞增殖活性比较：在GANT-61 10～100μmol/L的不同实验组中，随着作用时间延长，HL60/ADR与HL60/RX细胞抑制率显著提高，差异有统计学意义(P<0.05，表1)。

表1 不同组别的HL60/ADR与HL60/RX细胞抑制率比较

与0μmol/L比较，*P<0.05；与10μmol/L比较，#P<0.05；与50μmol/L比较，ΔP<0.05

2.细胞凋亡指数比较：随着GANT-61浓度的增加与作用时间的延长，HL60/ADR与HL60/RX细胞凋亡指数显著提高，差异有统计学意义(P<0.05，表2)。

表2 不同组别的HL60/ADR与HL60/RX细胞凋亡指数比较

与0μmol/L比较，*P<0.05；与10μmol/L比较，#P<0.05；与50μmol/L比较，ΔP<0.05

3.克隆形成指数比较：随着GANT-61浓度的增加与作用时间的延长，HL60/ADR与HL60/RX细胞的集落生成数目都显著降低，差异有统计学意义(P<0.05，表3)。

表3 不同组别的HL60/ADR与HL60/RX细胞集落生成数目比较

与0μmol/L比较，*P<0.05；与10μmol/L比较，#P<0.05；与50μmol/L比较，ΔP<0.05

4.蛋白表达比较：随着GANT-61浓度的增加与作用时间的延长，HL60/ADR与HL60/RX细胞的pAKT表达显著下降，NF-κB表达显著增加，差异有统计学意义(P<0.05，图1)。

图1 不同组别的HL60/ADR与HL60/RX细胞相关蛋白表达比较

讨 论

现代研究表明多条信号通路相互交叉是难治性AML发生、发展的一个重要机制[12]。Hedgehog蛋白最早发现于果蝇胚胎中，其具有3个同源性基因，包括Deserthedgehog(Dhh)、Sonic hedgehog(Shh)、Indian hedgehog(Ihh)等基因。Hedgehog通路由Hedgehog信号分子、Smoothened(Smo)、核转录因子Gli、膜受体patched(PTCH)等作用[13，14]。正常情况下，PTCH与Smo结合处于失活状态[14]。当Hedgehog通路激活后，激活的Smo与Gli结合，Hh配体与PTCH结合并内吞，促使Gli蛋白进入核内持续性激活，启动下游靶基因转录[15]。Hedgehog通路是胚胎发育和器官形成过程中重要的信号通路蛋白，在细胞生长发育、损伤修复再生中发挥重要作用，Hedgehog通路也是肿瘤细胞生成、转移、增殖中重要的信号传导通路。Hedgehog通路中Smo的特异阻断剂环巴胺对淋巴瘤有显著抑制作用，但对AML的作用却不显著[16]。Gli作为Hedgehog通路的关键物质，当前一些以Gli为靶点的抑制剂也得以发现。GGANT-6可以干扰Gli蛋白与细胞核内DNA的结合，从而下调Hedgehog通路的作用[17]。本研究显示随着GANT-61浓度的增加与作用时间的延长，HL60/ADR与HL60/RX细胞的凋亡指数与细胞增殖抑制率显著提高，差异有统计学意义。相关研究也表明Hedgehog通路的Gli蛋白表达与急性髓细胞白血病患者的无病生存率、无复发生存率、总生存率呈负相关，抑制该通路表达可以提高抗肿瘤治疗作用[18]。

Hedgehog是哺乳动物体内广泛存在的一种分泌性蛋白，Hedgehog通路与肿瘤细胞的凋亡、血管形成、增殖、分化密切相关，当Hedgehog通路调节失控，促使Gli蛋白持续性激活、启动下游靶基因转录[19]。当使用抑制剂阻滞Hedgehog通路转导途径后，抵抗射线的细胞对射线的敏感度显著提高，提示Hedegehog通路在难治性AML治疗抵抗方面可能发挥重要作用[20]。集落生成实验可反映单个肿瘤细胞增殖能力，其中单个细胞体外增殖6代以上，其后代形成的细胞集落被称为克隆。本研究显示随着GANT-61浓度的增加与作用时间的延长，HL60/ADR与HL60/RX细胞的集落生成数目都显著降低，差异有统计学意义。相关研究表明GANT-61可直接作用于Hedgehog通路的转录因子Glil/2，特异性地阻滞Glil/2所介导的下游靶基因激活，从而抑制肿瘤细胞的增殖[21]。还有研究表明Hedgehog通路阻断剂Cyclopamine也显著降低效应蛋白Gli-1的表达水平，继而显著增加胰腺癌细胞的放射敏感度，表现为肿瘤的放射效应显著增加，因此推测该信号通路将会是临床上增加难治性AML放射敏感度的潜在靶点[22]。

Hedgehog通路与肿瘤细胞增殖、凋亡、促进血管形成密切相关，参与白血病的发生、发展。Hedgehog通路的下游靶基因主要包括癌基因N-myc、AKT、NF-κB等[23]。研究表明Hedgehog通路可以通过PI3K/AKT途径来行使促进细胞生长、增殖、迁移作用，并与NF-κB信号活化具有相互促进作用[24]。肿瘤细胞PI3K/AKT信号通路可以通过激活多种下游靶蛋白而发挥其功能，其中pAKT激活IκB激酶，降解IκB而使NF-κB活化进入细胞核而促进恶性肿瘤细胞生长。相关研究也表明PI3K/AKT通路的活化与肿瘤的耐药和放射抵抗均有相关性，抑制该通路的活性可以逆转细胞的耐药性，增强放射敏感度。本研究显示随着GANT-61浓度的增加与作用时间的延长，HL60/ADR与HL60/RX细胞的pAKT表达显著下降，NF-κB表达显著增加，差异有统计学意义，表明抑制Hedgehog通路可抑制AKT的活化，使得NF-κB转移至细胞核内行使其功能，从而抑制细胞增殖与促使肿瘤细胞凋亡。

综上所述，Hedgehog通路可以通过调节PI3K/AKT/NF-κB途径，抑制难治性AML细胞的增殖，促进细胞调查，对临床治疗难治性AML提供一个潜在的有效方法。