乳腺癌中SyK、HGF表达的相关性及预后的关系

庄晓苹 林琼琼 季剑乐 朱 暐

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，在国内发生率明显上升，且发病年龄有低龄化的趋势，其具体发病原因及机制尚未完全阐明[1]。脾酪氨酸激酶基因(spleen tyrosine kinase，SyK) 目前引起了国内外研究者的广泛重视，认为SyK基因是一种新发现的候选抑癌基因，可以预测乳腺癌预后情况的指标之一。有研究表明肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)异常表达提示肿瘤的预后不良及低生存率[2]。本研究通过实时PCR检测SyK、HGF mRNA在乳腺癌中表达情况，进而探讨SyK、HGF在乳腺癌侵袭和转移中的作用以及预后的相关性。

材料与方法

1.标本来源：收集于2012～2015年笔者医院病理科石蜡标本，正常乳腺组织100例，纤维腺瘤100例，乳腺癌组织120例。收集的病例均有完整的临床病理资料和随访资料(表1)。根据2012年第4版的WHO乳腺肿瘤分类[3]，按照分析乳腺小管和腺体的分化程度、肿瘤细胞核的多形性、病理核分裂象计数等进行肿瘤分级：组织学分级Ⅰ、Ⅱ级者72例，Ⅲ级者48例；临床分期Ⅰ、Ⅱ期者75例，Ⅲ期者45例；有脉管侵犯者34例、无侵犯者86例；腋窝淋巴有结转移者43例、无转移者77例。患者术前均未接受任何治疗方案，包括放射治疗、化学治疗或激素治疗。

表1 乳腺癌组织中SyK、HGF mRNA表达和临床病理学参数之间的关系

2.检测试剂：Total试剂购自于美国Invitrogen公司；石蜡标本RNA分离和扩增试剂盒购自美国Ambion公司；引物设计和合成均由上海生物工程有限公司制作。

3.研究方法：(1)石蜡标本RNA提取法：将切下的蜡膜放在二甲苯中，室温孵育10min，石蜡混匀颠倒，使组织得到充分溶解。用100%无水乙醇洗涤2次，去除残留的二甲苯，然后干燥呈片状沉淀物[4]。(2)RNA提取及纯化：按照RecoverAllTMTotal Nucleic Acid Isolation Kit for FFPE试剂盒的说明书步骤提取总RNA。(3)RNA 溶解：纯化后的RNA 用60U/L elution溶解, 分装。用20μl来检测RNA 质量与反转录，剩余的标本保存-80℃冰箱备用。(4)实时PCR方法：用TRIzol 法提取标本总RNA，反转录反应按照试剂盒说明书进行操作。PCR反应以25μl为体系，取cDNA 2μl，加入试剂 10×buffer 2.5μl、dNTP 0.5μl、MgCl21μl及TaqDNA 聚合酶0.3μl。SyK上游引物: 5′-CATGGAAAAATCTCTCGGGAAGA-3′, 下游引物: 5′-GTCGATGCGATAGTGCAGCA-3′；HGF上游引物: 5′-GCTATCGGGGTAAAGACCTACA-3′, 下游引物: 5′-CGTAGCGTACCTCTGGATTGC-3′；内参β-actin上游引物: 5′-AGAGCTACGAGCTGCCTGAC-3′；下游引物: 5′-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3′。上下游引物各加0.75μl、纯净水16.4μl。反应条件： 94℃预变性10min、94℃变性30s、54℃退火30s，72℃延伸1min 45s，35个循环；72℃终末延伸10min。用DEPC水代替cDNA 做阴性对照，用扩增GAPDH 作为内参照。

4.结果判定：用实时PCR检测石蜡标本中SyK、HGF mRNA相对表达量，应用2-ΔΔCt法分析目的基因和内参基因的Ct值，以GAPDH为内参基因，以正常乳腺组织为对照组，SyK、HGF相对表达量公式计算：folds=2-ΔΔCt，ΔΔCt= (Ct目的基因-Ct内参照基因)研究组- (Ct目的基因-Ct内参照基因)对照组，通过计算乳腺癌组织中SyK、HGF mRNA相对于正常乳腺组织、纤维腺瘤表达之间的差异性[4,5]。

5.随访结果：随访截止时间为2017年5月31日，共随访患者120例，随访时间 1～60个月，生存中位数为47个月。120例患者中无病生存88例，出现局部复发或远处转移共24例，死于乳腺癌复发转移5例，死于其他原因3例。

结 果

1.SyK、HGF mRNA不同乳腺组织相对表达量:SyK mRNA正常乳腺组和纤维腺瘤组相对表达量为(t=0.978,P=0.333)；正常乳腺组和乳腺癌组相对表达量为(t=40.810,P<0.01)；纤维腺瘤组和乳腺癌组相对表达量为(t=34.240，P<0.01)。HGF mRNA正常乳腺组和纤维腺瘤组相对表达量为(t=2.248,P=0.029)；正常乳腺组和乳腺癌组相对表达量为(t=3.760,P=0.000)；纤维腺瘤组和乳腺癌组相对表达量为(t=3.371,P=0.001)。相对表达量符合正态分布(P>0.05)，SyK、HGF mRNA乳腺癌相对表达量明显高于正常乳腺组和纤维腺瘤组，两者比较差异有统计学意义(P<0.01,图1)。

图1 SyK、HGF mRNA在不同乳腺组织的相对表达量

2.SyK、HGF mRNA表达和乳腺癌组织临床病理学参数之间的关系:SyK、HGF mRNA表达与乳腺癌的临床分期、有脉管侵犯相关(P<0.05)，但与年龄、肿块直径无关(P>0.05)。其中SyK与组织学分级相关(P<0.05)，HGF与淋巴结转移相关(P<0.05，表1)。

3.乳腺癌中 SyK、HGF 的表达与患者生存的关系:120例乳腺癌患者的随访结果为术后5 年内死亡人数为8例，占6.67%(8/120)，生存中位数时间为47个月，根据乳腺癌SyK、HGF的表达状况将患者分为两组:(1)比较组：SyK+/HGF+(18例)、SyK+/HGF-(10例)、SyK-/HGF-(15例)。(2)预后组：SyK-/HGF+(77例)；因比较组的3组数据较小，合并成一组为比较组。采用Kaplan-Meier法对120例乳腺癌患者的随访结果进行统计学分析处理,结果显示对两组生存曲线整体比较的LogRank检验结果为P=0.009，Breslow检验结果为P=0.018。LogRank检验的结果显示，两组表达对患者的生存率有差异，预后组与生存状态负相关(r=-0.202，P<0.05)，该两组5年生存情况生存曲线，详见图2。

图2 SyK、HGF不同表达与乳腺癌患者生存时间的关系

讨 论

研究证明，乳腺癌的发生、浸润、侵袭及转移是多因素参与、多基因调控、多步骤发展的复杂过程，且与许多生物学指标密切相关[6]。SyK是一种备选抑癌基因，其表达的缺失引起免疫细胞发育成熟障碍，使机体的免疫监视能力逐渐下降，致使机体对基因突变、细胞的异常增生失去免疫力，从而引发肿瘤[7]。临床及实验研究发现SyK表达下调或缺失与多种恶性肿瘤的浸润、侵袭及转移密切相关，如结肠癌、肺癌、鼻咽癌、视网膜母细胞瘤等恶性肿瘤中均表明SyK表达下调或缺失，恶性程度越高的肿瘤SyK表达缺失的现象越明显[8～11]。本研究SyK mRNA在乳腺癌中表达明显低于正常乳腺组和纤维腺瘤组，两者比较差异有统计学意义(P<0.01)，说明SyK表达下调或缺失与乳腺恶性肿瘤发生有着密切关联。正常乳腺组织、纤维腺瘤中SyK高表达，可能提示SyK对体内肿瘤细胞的发生、发展有一定的抑制作用，从而维持良性的组织学特性。在临床病理参数中，SyK mRNA表达缺失与乳腺癌的临床分期、组织学分级、脉管侵犯相关(P<0.05)，这与 Ghotra等[12]研究结果相符。乳腺癌临床分期越晚、组织学分级越差、有脉管侵犯者等SyK表达缺失越严重，这说明SyK表达缺失的现象与乳腺癌具有更高的侵袭性、转移以及预后不良因素密切相关。

HGF是属于受体酪氨酸蛋白激酶家族成员之一，具有多种生物学效应的一种血源性生长因子,能促进淋巴管的生成和血管内皮细胞的增殖。正常组织存在低表达，在恶性肿瘤组织呈高表达[13]。研究显示，HGF过表达与配体c-Met 相结合作用，可通过旁分泌或自分泌途径激活多种信号通路，引起直接或间接反应，从而刺激肿瘤发生、浸润及转移[14]。研究证实，HGF在黑色素瘤、肝癌、卵巢癌、恶性间皮瘤等恶性肿瘤中均呈高表达[15～18]。本研究HGF mRNA在乳腺癌中明显高于正常乳腺组和纤维腺瘤组，两者比较，差异有统计学意义(P<0.01)，各项临床参数中HGF mRNA表达与乳腺癌的临床分期、淋巴结转移、有脉管侵犯者相关(P<0.05)，与Hao等[19]研究结果相一致。这结果提示HGF高表达促进肿瘤细胞的增殖、癌变，同时又促进血管内皮细胞增生，导致恶性肿瘤细胞的侵袭和转移。HGF与淋巴结转移相关，提示HGF可能有促进淋巴管的增生，增加肿瘤与淋巴管之间的接触面积，便于肿瘤细胞进入淋巴管的机会，从而导致淋巴结转移。淋巴结转移是乳腺癌的主要转移方式，也是乳腺癌死亡或复发的重要因素，进一步说明HGF过表达是乳腺癌的早期发现、早期诊断以及判断预后不良的指标之一。

在乳腺癌传统的预后判定指标有：年龄、肿块直径、组织学分级、临床分期等，临床情况相同的患者中，却有着不同的预后结果，因此不能根据传统的预后指标来判断，并且制定治疗方案，应要结合其他生物学指标，比如SyK、HGF等指标进行综合判断。本研究根据乳腺癌中SyK、HGF 的表达情况将患者分为比较组与预后组(SyK-/HGF+)，采用Kaplan-Meier法对120例乳腺癌患者的随访结果进行统计学分析处理,结果显示对两组生存曲线整体比较的LogRank检验结果为P=0.009，Breslow检验结果为P=0.018。按照LogRank检验的结果，SyK和HGF表达与否对患者的生存率有显著影响，预后组与生存状态呈负相关(r=-0.439，P<0.05)，从生存曲线图可知，乳腺癌患者中SyK缺失或HGF过表达者，其患者生存时间均低于SyK高表达或HGF低表达者。说明患者SyK表达的越低、HGF表达的越高，提示肿瘤的恶性程度就越高，加速肿瘤向远处转移的概率会更大，患者预后会更差。因此可以说明SyK和HGF是预后独立因素，可作为乳腺癌预后判断的指标之一。