食管癌组织环状-TTBK2和miR-217表达及临床病理意义

徐勇军 彭 琴 谭峥嵘 龙丹丹 魏亚元 徐继宗

食管癌(esophageal cancer)是由于食管上皮组织异常增生引起的一种常见消化道恶性肿瘤。流行病学研究表明，我国是食管癌高发地区，每年新增病例约占世界发病人数的一半[1]。由于食管癌早期症状不典型，多数患者确诊时已发展至中晚期，错过最佳治疗时机，预后效果差，病死率较高[2]。不良饮食习惯、环境因素及遗传易感因素等均可能导致食管癌的发生，但其发病的具体机制尚不清楚。因此，研究食管癌发生发展的机制，寻找防治食管癌的有效生物学靶标，可为食管癌的早期诊断、临床治疗及预后提供新思路。多项研究表明，微小RNA(miRNAs)参与多种生理生化过程，其异常表达与炎症、癌症等多种疾病的发生相关[3]。Li等[4]发现，miR-217在人卵巢上皮癌组织中显著下调表达，过表达miR-217可促进卵巢上皮癌细胞的生长和迁移，但关于miR-217与食管癌的关系研究较少。

近年来研究表明，基因在转录时并不总是产生线性RNA，也会形成一些3′末端与5′末端相连的非编码环状RNAs，环状RNAs结构稳定，在血液和组织中与核内体或微囊结合，可作为疾病的生物学标志物[5]。Tau微管蛋白激酶2(Tau tubulin kinase 2，TTBK2)是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，是一种参与重要细胞过程的多功能激酶，维管系统参与多种细胞功能，是神经细胞骨架主要成分，Tau具有稳定微管的作用，在微管相关蛋白中含量最高，TTBK2环状RNA通过调节miR217等途径调控胶质瘤恶性[6]。因此，本研究通过检测并比较miR-217、环状-TTBK2在食管癌肿瘤组织与癌旁组织中的表达情况，探讨二者与食管癌临床病理特征及预后的关系。

材料与方法

1.标本采集:选取2013年3月～2015年3月笔者医院病理科收集的食管癌患者术后肿瘤组织及对应癌旁组织标本各69例为研究对象，患者年龄47～79岁，平均年龄59.67±10.23岁，其中食管病变部位：上段11例，中段40例，下段18例；病理类型：57例鳞癌、12例非鳞癌；肿瘤分化程度：高分化患者14例、中分化患者21例、低分化患者34例；浸润深度：T1～T2患者30例，T3～T4患者39例；淋巴结转移患者41例，淋巴结无转移患者28例；根据国际抗癌协会TNM分期标准，Ⅰ期14例，Ⅱ期19例，Ⅲ期36例[7]。对所有入选患者进行为期3年的随访，并做好记录，随访日期截止2017年4月30日。纳入标准：①经病理诊断首次确诊为食管癌患者的组织标本；②年龄不超过80岁患者的组织标本；③明确TNM分期及病理分化标本；④癌旁组织距肿瘤病灶组织距离超过5cm的组织标本；⑤患者的临床及随访资料完整。排除标准：①非首次确诊食管癌患者；②转移性食管癌患者；③其它恶性肿瘤；④术前行放化疗等其他辅助治疗患者；⑤临床或随访资料不完整患者。于术中分别收集食管癌肿瘤组织和癌旁组织，切成小块(每块体积1.0cm×1.0cm×1.0cm)，冲洗干净后置于Trizol试剂中，-80℃保存。该研究经过笔者医院医学伦理学委员会批准通过，标本采集和研究过程均符合赫尔辛基宣言。

2.主要试剂与仪器:Trizol试剂购自日本TaKaRa公司；AceQ qPCR SYBR®Green Mix购自南京vazyme生物公司；MystiCq®microRNA qPCR Assay Primer购自美国Sigma公司；qRT-PCR引物由上海生工生物公司合成等；qRT-PCR仪购自美国Bio-Rad公司等。

3.实时荧光定量PCR(quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)检测miR-217、环状-TTBK2表达水平：Trizol法提取两组食管组织总RNA，反转录获得cDNA。按照AceQ qPCR SYBR®Green Mix试剂盒说明书对miR-217、环状-TTBK2进行扩增。反应体系：正、反向引物(10μmol/L)各0.5μl，SYBR®Green Mix 5.0μl，cDNA(50ng/μl)1.0μl，ddH2O 3.0μl，共10.0μl。反应条件：95℃，90s；95℃，30s；62℃，30s；72℃，20s；40个循环，采用qRT-PCR仪进行检测，通过溶解曲线评价qRT-PCR扩增产物的特异性。反应结束后，采用2-ΔΔCT法对扩增结果进行定量分析。qRT-PCR引物序列详见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

结 果

1.食管肿瘤组织及癌旁组织中miR-217、环状-TTBK2表达水平的比较:食管癌肿瘤组织中miR-217相对表达水平显著低于癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.05)；食管癌肿瘤组织中环状-TTBK2相对表达水平显著高于癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.05)，详见表2。

表2 不同食管组织中miR-217、环状-TTBK2 表达水平的比较

2.食管癌患者肿瘤组织中miR-217与环状-TTBK2表达的相关性:Pearson分析结果显示，食管癌患者肿瘤组织中miR-217与环状-TTBK2表达呈显著负相关(r=-0.609)，差异有统计学意义(P<0.05)，详见图1。

图1 食管癌患者肿瘤组织miR-217与环状-TTBK2表达的相关性

3.食管癌患者肿瘤组织中miR-217、环状-TTBK2表达情况与临床病理特征的关系：以69例食管癌患者肿瘤组织中miR-217和环状-TTBK2的平均水平为截断值，将患者分为miR-217低表达组41例，miR-217高表达组28例，环状-TTBK2低表达组26例，高表达组43例。不同年龄、性别、病变部位、病理类型、肿瘤浸润深度的食管癌患者肿瘤组织中miR-217、环状-TTBK2表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)；不同TNM分期、肿瘤分化程度及淋巴结转移情况的食管癌患者肿瘤组织中miR-217、环状-TTBK2表达水平比较，差异有统计学意义(P<0.05)，详见表3。

4.不同miR-217、环状-TTBK2表达食管癌患者3年总生存率的比较:如图2所示，miR-217低表达者3年存活率为41.46%(17/41)，明显低于miR-217高表达者3年存活率78.57%(22/28,χ2=9.238，P<0.05)；环状-TTBK2高表达者3年存活率为37.21%(16/43)，明显低于环状-TTBK2阴性表达者3年生存率88.46%(23/26，χ2=15.780，P<0.05)。

5.影响食管癌患者预后的COX回归分析:本研究将患者miR-217表达、环状-TTBK2表达、年龄分层、性别、病变位置、病理类型、浸润深度、肿瘤分化、淋巴结转移、TNM分期等因素，纳入影响食管癌患者预后的COX比例风险模型进行分析。单因素分析结果显示，miR-217表达、环状-TTBK2表达、浸润深度、肿瘤分化、淋巴结转移、TNM分期是影响食管癌患者预后的危险因素，详见表4。多因素分析显示，miR-217表达、环状-TTBK2表达、TNM分期是影响食管癌患者预后的独立危险因素，详见表5。

讨 论

食管癌是临床上一种较为常见的消化道恶性肿瘤，多发生于40岁以后，其典型临床症状是进行性吞咽困难。据报道，目前我国食管癌的发生率高达0.05%以上，是世界上高发病地区之一，每年约20万人死于该种疾病，且发生率呈逐年升高的趋势[8]。现阶段对于食管癌的病因尚不明确，认为由多种因素引起的食管鳞状或腺状上皮的持续性病变，最终都可能发展为食管癌。研究显示，食管癌的5年存活率低于45%，中位存活时间不到32个月，病死率较高，易出现发和转移，远期预后效果较差[9]。因此，探索食管癌的发病机制，寻找有效生物学分子标志物，可为食管癌的临床靶向治疗和预后判断提供新思路。

表3 食管癌患者肿瘤组织中miR-217、环状-TTBK2表达情况与临床病理特征之间关系

图2 不同miR-217、环状-TTBK2表达食管癌患者3年总生存率的比较

表4 影响食管癌患者预后单因素COX回归分析结果

项目HR95% CIPmiR-217表达3.5761.237～10.3380.000环状-TTBK2表达3.8541.569～9.4670.000年龄1.6150.577～4.5200.251性别1.7340.491～6.1240.134病理类型1.2480.679～2.2940.616浸润深度1.9761.109～3.5210.043肿瘤分化2.5471.011～6.4170.035淋巴结转移3.0391.348～6.8510.015TNM分期3.6431.914～6.9340.000

表5 影响食管癌患者预后多因素COX回归分析结果

微小RNA(microRNA，miRNA)含有18～25个核苷酸，是真核生物细胞内一类高度保守的内源性单链非编码RNA，能与靶基因mRNA 3′非编码区特异性结合，调节基因转录和表达，在细胞增殖、细胞分化及细胞凋亡等生理生化过程中发挥非常重要的作用[10]。Ansari等[11]发现，miR-93、miR-143在食管鳞状细胞癌肿瘤组织中表达明显降低，可作为食管鳞癌的潜在生物学标志物。Wang等[12]研究发现，miR-625在食管癌组织中表达下调，低表达miR-625可促进食管癌细胞增殖、迁移，过表达miR-625则抑制食管癌细胞增殖、迁移，提示miR-761有望作为食管癌的治疗靶点。Winther等[13]研究表明，miR-21在食管鳞癌和食管腺癌肿瘤组织中表达上调，miR-21高表达与食管鳞癌和食管腺癌患者的疾病特异性、生存率和总生存率较差有关，是影响患者不良预后的独立危险因素，提示miR-21有望作为评价食管癌患者预后情况的生物学标志物。以上研究表明miRNAs在食管癌发生、发展过程中具有抑癌或致癌作用，可作为食管癌的潜在预后生物学标志物和治疗靶点，然而miR-217在食管癌发生、发展过程中的作用尚不清楚。

miR-217是哺乳动物常见的miRNA之一，存在于多种细胞、组织中。Su等[14]发现，miR-217在转移性肝癌组织和高侵袭性肝细胞癌细胞系MHCC-97H细胞中的表达较低，过表达miR-217抑制MHCC-97H细胞侵袭能力，表明miR-217可能作为潜在的肿瘤抑制因子参与肝细胞癌的疾病进展。Lin等[15]分析发现，miR-217在甲状腺癌组织和细胞系中表达下降，与患者临床分期、淋巴结转移情况有关，细胞实验表明，过表达miR-217可显著抑制甲状腺癌细胞的增殖、迁移及侵袭，同时可抑制体内肿瘤的生长，提示miR-217作为抑癌因子参与甲状腺癌的发展。Zhang等[16]发现miR-217在结肠癌组织中表达显著高于癌旁组织，与结肠癌患者的临床分期及总体生存率有关，过表达miR-217 可抑制胃癌细胞增殖，促进细胞凋亡，推测miR-217可能作为致癌因子参与结肠癌的发生。以上研究结果显示，miR-217在恶性肿瘤发展和进展中既可作为抑癌基因也可作为致癌基因发挥作用。

本研究对69例食管癌肿瘤组织及对应癌旁组织进行检测，发现食管癌组织中miR-217表达水平显著降低，与miR-217等在肝细胞癌、甲状腺癌中的表达模式一致[14,15]。提示miR-217在食管癌中可能作为抑癌基因发挥作用。本研究中miR-217表达与食管癌患者TNM分期、肿瘤分化程度及淋巴结转移有关，随着患者TNM分期的升高、分化程度的降低，肿瘤组织中miR-217表达水平逐渐升高，有淋巴结转移的患者肿瘤组织中miR-217表达水平高于未转移患者。其中TNM分期和病理分化可反肿瘤的分化程度，分期分级越高，分化程度越差，肿瘤的恶性程度越高，提示miR-217低表达参与食管癌疾病的进展，与肿瘤恶性程度有关。进一步分析发现，miR-217低表达者3年存活率显著低于miR-217高表达者，提示miR-217低表达与食管癌患者3年存活率有关，影响患者的预后，推测miR-217可作为反应食管癌恶性程度和患者预后的生物学标志物。

环状RNAs是一类不编码蛋白质的ncRNAs，大多数环状RNA都来自外显子区域，且多数分布于细胞质中。近期研究表明，环状RNAs在胃癌、结肠癌等消化系统肿瘤中异常表达，参与恶性肿瘤的发生，逐渐作为一种新型生物学标志物应用于癌症疾病的筛查[17，18]。Tau微管蛋白激酶2(Tau tubulin kinase 2，TTBK2)是一种激酶，可催化Tau蛋白和微管蛋白磷酸化而激活[19]。Bender等[20]发现，线性TTBK2过表达与肾癌细胞系和黑色素瘤细胞系的耐药性密切相关。Zheng等[21]报道称，在胶质瘤组织和细胞系中均发现环状-TTBK2表达显著上调，而线性-TTBK2表达无显著变化，体外实验进一步发现，过表达环状-TTBK2促进胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭，敲除环状-TTBK2则可导致体内肿瘤的回归，提示环状-TTBK2高表达促进胶质瘤进展。

本研究发现，食管癌肿瘤组织中环状-TTBK2表达水平显著升高，与Zheng等[21]在胶质瘤中发现一致，提示环状-TTBK2 在食管癌发生过程中可能作为致癌基因发挥作用。本研究中环状-TTBK2表达与食管癌患者TNM分期、肿瘤分化程度及淋巴结转移有关，随着患者TNM分期的升高、分化程度的降低，肿瘤组织中miR-217表达水平逐渐升高，提示环状-TTBK2 高表达可能参与食管癌疾病进展。进一步分析发现，环状-TTBK2高表达者3年存活率显著低于环状-TTBK2低表达者，提示环状-TTBK2高表达与食管癌患者的生存率有关，影响患者的预后，推测环状-TTBK2可能作为判断食管癌患者疾病程度和预后情况的生物学标志物。本研究采用COX比例风险模型对影响食管癌患者预后的危险因素进行分析，结果显示，miR-217表达、环状-TTBK2表达、TNM分期是影响食管癌患者预后的独立危险因素，提示检测食管癌肿瘤组织miR-217、环状-TTBK2表达情况可评估患者预后情况。另外，Pearson分析表明，食管癌肿瘤组织中miR-217与环状-TTBK2表达呈负相关，表明二者某种方式相互作用，然而具体以何种方式共同参与调节食管癌的发生和进展仍不明确，将在进一步研究中进行探索。

综上所述，本研究结果显示，miR-217在食管癌患者肿瘤组织中低表达，环状-TTBK2高表达，二者表达与患者TNM分期、肿瘤分化程度及淋巴结转移及3年存活率有关，是影响食管癌患者预后的独立危险因素，推测二者可能作为治疗食管癌的潜在靶标，并用于判断患者预后。