miR-802和RAB23在食管鳞癌中的表达水平及临床意义

蒋庆锋 程金华 申思宁 程纪伟 邢文群

食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)主要发生于食管内且向鳞状上皮分化形成的一种恶性肿瘤，常发生于生理性或病理性狭窄处，具有较高发生率及预后差等特性[1]。目前肿瘤诊断及治疗水平的提高，但食管鳞癌的治疗及预后无明显改善。研究表明食管鳞癌的发生与原癌基因、抑癌基因等有关[2]。miRNA(microRNA)是一类内源性非编码RNA分子且在肿瘤发生、发展中发挥抑癌或促癌的作用，研究表明miR-802可在舌鳞状细胞癌中抑制肿瘤细胞的增殖及分化[3]。研究证实RAB23在胃癌组织中上调表达并促进肿瘤细胞的侵袭及迁移[4]。目前关于miR-802与RAB23在食管鳞癌中的研究相对较少，因此本研究主要探讨食管鳞癌组织中miR-802与RAB23表达水平并探究二者是否具有相关性及其临床意义。

资料与方法

1.一般资料:收集120例笔者医院病理科2014年3月～2015年2月期间进行食管鳞癌切除手术的标本为食管鳞癌组，另选取癌旁正常组织为对照组，所有患者均经病理证实为食管鳞状癌。食管鳞癌组120例，其中男性57例，女性63例，患者年龄45～70岁，平均年龄59.25±6.56岁。正常组120例，其中男性53例，女性67例，患者年龄47～72岁，平均年龄60.86±5.15岁。收集两组临床病理资料，包括肿瘤直径、淋巴结转移、TNM分期、组织分化程度、浸润程度等。按照食管癌TNM分期标准分为Ⅰ期19例，Ⅱ期22例、Ⅲ期48例、Ⅳ期31例[5]。根据评估组织分化程度：高分化 28例、中分化 51例、低分化 41例[6]。纳入标准：①食管鳞癌癌患者均经手术病理证实；②未进行化学治疗或放射治疗者；③病灶无明显坏死区；④患者知情且签署同意书。排除标准：①自身免疫性疾病者；②具有明显炎性细胞浸润癌旁组织；③严重肾脏损伤者；④临床资料不全者。两组临床资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

2.研究方法：(1)采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)法食管鳞状细胞组织中miR-802与RAB23 mRNA相对表达量：取出超低温冰箱内保存的食管鳞状细胞组织样本，利用Trizol(北京恩硕科技有限公司)提取组织总RNA，按照反转录试剂盒(北京天根生化科技有限公司)操作步骤将2μgRNA反转录为cDNA，之后按照SYBR Green RCR master mix试剂(北京恩硕科技有限公司)说明配反应体系并加样。其中miR-802以U6为内参基因，RAB23以GADPH为内参基因，引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物设计详见表1。qRT-PCR反应体系共为20μl，其中SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10μl，cDNA 2μl，上下游引物各0.8μl，ROX Reference Dye(50×)0.4μl，ddH2O 6μl。每个样品设置3个生物学重复，完成后将其放入荧光定量PCR仪上进行反应，程序设定为：95℃1min，95℃ 15s，60℃ 15s，72℃ 15s，共42个循环，72℃延伸10min。反应结束后收集数据，并对所得数据Ct值进行分析，采用2-ΔΔCt算法计算miR-802与RAB23 mRNA的相对表达量。(2)免疫组化法检测食管鳞状细胞组织中RAB23蛋白表达:食管鳞状细胞组织用石蜡包埋制作石蜡切片并经二甲苯脱蜡，将其在不同梯度(100%、95%、80%、70%)乙醇中脱水后置于柠檬酸盐溶液中1min，PBS(0.01mmol/L磷酸盐缓冲液)清洗后并滴加3%H2O2室温下反应30min，PBS清洗3次且每次清洗时间为5min，清洗后加入山羊抗兔血清反应60min，反应后滴加稀释后(1∶200)的RAB23一抗，放入4℃冰箱过夜，次日取出切片并用PBS清洗3次， 加入抗辣根过氧化物酶标记的二抗，置于37℃温箱孵育1h，PBS清洗后加入DAB(二氨基联苯氨)显色液进行显色反应，蒸馏水清洗后采用苏木素复染，经蒸馏水冲洗后置于1%盐酸中5s后清洗，用中性树脂进行封片，置于显微镜下进行观察。

表1 qRT-PCR引物序列

3.结果判定:从每个切片中选取5个高倍视野(×400)中随机挑选并对阳性染色细胞数量进行统计[7]。观察并记录两项指标：阳性细胞百分比与染色程度。按照染色程度：无色0分；淡黄色1分；棕褐色2分。按照阳性细胞百分比：<10%记为0分；10%～25%记为1分；26%～50%记为2分；>50%记为3分。取两组计分之乘积：0分为阴性，≥1分为阳性。

4.随访:通过打电话或复诊的方式对所有患者均进行3年随访，并统计无生存进展期(PFS)即患者开始治疗到肿瘤进展或死亡这一段时间与总体生存时间(OS)即从随机化开始至因任何原因引起死亡的时间。

结 果

1.两组miR-802与RAB23 mRNA表达水平的检测结果:两组miR-802、RAB23 mRNA水平存在明显差异，食管鳞癌组患者miR-802表达水平低于正常组，而RAB23 mRNA表达水平高于正常组，差异有统计学意义(P<0.05),详见表2。

表2 两组miR-802、RAB23 mRNA表达量检测结果

与正常组比较，*P<0.05

2.食管鳞癌及癌旁组织中RAB23蛋白表达情况:免疫组化组显示RAB23在细胞核中表达，染色呈淡黄黄色、棕褐色，详见图1。与正常组比较，食管鳞癌组RAB23蛋白阳性表达增强，差异有统计学意义(t=17.342,P<0.05)，详见表3。

图1 食管鳞癌及癌旁组织中RAB23蛋白表达情况(免疫组化，×400)A.RAB23阴性表达;B.RAB23阳性表达

表3 食管鳞癌及癌旁组织中RAB23蛋白表达

组别nRAB23阴性阳性阳性率(%)正常组120784235.00食管鳞癌组120348671.67

3.miR-802、RAB23表达与食管鳞癌患者临床病理参数的关系:根据miR-802检测结果的中位值将其分为高表达组共42例，低表达组共78例，观察miR-802、RAB23表达与食管鳞癌患者临床病理参数的关系，结果显示miR-802与组织分化程度、TNM分期、浸润程度相关，RAB23与淋巴结转移、TNM分期及组织分化程度相关，差异有统计学意义(P<0.05),详见表4。

4.食管鳞癌组织中miR-802与RAB23表达水平的相关性分析:Pearson相关性分析miR-802与RAB23表达水平的相关性，结果显示miR-802与RAB23呈负相关，差异有统计学意义(P<0.05),详见图2。

5.食管鳞癌组织中miR-802、RAB23表达与患者预后的关系：Kaplan-Meier曲线显示，miR-802、RAB23均与患者PFS、OS密切相关。miR-802高表达组PFS、OS(77.03%、69.25%)均高于低表达组(19.44%、22.41%)，RAB23阴性表达组PFS、OS(76.97%、63.94%)均高于阳性表达组(23.19%、20.28%)，差异有统计学意义(P<0.05)，详见图3、图4。

讨 论

食管癌是一种消化系统常见的恶性肿瘤且具有较高发生率，但其发病机制尚未完全清楚，而食管鳞癌是食管癌的主要类型且患者预后差[8]。食管鳞癌确诊时已处于中、晚期且已出现肿瘤细胞转移及浸润而降低患者生存率，目前临床常采用手术与放射治疗、化学治疗结合的方式进行治疗，但不敏感患者治疗效果不明显。随着现代科技的进步，癌症依靠分子标志物进行诊断已取得较好的临床治疗效果，但对食管鳞癌分子标志物的研究相对较少，因而寻求用于早期检测食管鳞癌及其预后的分子标志物具有重要指导意义。miRNA是一类内源性非编码小RNA分子并可参与调控转录后基因表达的过程，已有研究表明，miRNA可通过调控下游基因的表达进而参与肿瘤形成、转移及代谢过程[9]。近来研究发现大量miRNA可在食管鳞癌中发挥促癌或抑癌的功能并可用于临床诊断或评估预后[10]。因此，探究食管鳞癌组织中miRNA的表达对于研究食管鳞癌的发生、发展具有十分重要的意义。

表4 食管鳞癌组织中miR-802、RAB23表达与临床病理特征的关系[n(%)]

图2 miR-802与RAB23表达水平的相关性分析

图3 食管鳞癌患者miR-802表达与PFS、OS的关系A.PFS曲线;B.OS曲线

图4 食管鳞癌患者RAB23表达与PFS、OS的关系A.PFS曲线;B.OS曲线

miR-802位于人类21染色体上，研究表明miR-802与多种恶性肿瘤发生、发展有关[11]。miR-802可通过调控靶基因FoxM1表达而抑制乳腺癌细胞增殖及迁移[12]。研究表明miR-802在前列腺癌组织中过表达时可通过调控Flot-2表达进而抑制癌细胞中EMT的迁移及侵袭，miR-802可能为抑癌基因[13]。目前关于miR-802在食管鳞癌组织中的表达研究相对较少，本研究通过qRT-PCR法检测食管鳞癌组织及癌旁组织中miR-802表达量，结果显示食管鳞癌组中miR-802表达显著低于正常组，说明食管鳞癌组织中miR-802呈下调表达，且miR-802参与食管鳞癌发生、发展过程。根据miR-802检测结果的中位值分为高表达组与低表达组，并观察其与患者临床病理参数的关系，结果显示miR-802与组织分化程度、TNM分期、浸润程度显著相关，且TNM分期为Ⅰ～Ⅱ期时miR-802高表达比率较高而Ⅲ～Ⅳ期时miR-802呈显著低表达趋势，说明miR-802在食管鳞癌的进展及转移过程中呈低表达并可能发挥抑癌基因的作用。同时本研究对miR-802表达与食管鳞癌的预后关系进行研究，Kaplan-Meier曲线显示miR-802高表达组PFS、OS均显著高于低表达组，说明miR-802低表达与食管鳞癌患者预后不良有关，推测miR-802表达与食管鳞癌发生、发展有关并可作为判断疾病进展及评估患者预后的分子标志物。

RAB23位于人类染色体6p12.1是一种小GTP酶且属于致癌基因，研究表明RAB23是多种恶性肿瘤的靶点，上游基因调控RAB23表达并可发挥肿瘤启动子的作用[14]。相关研究表明RAB23可通过整合素β1/Rac1途径进而促进鳞状细胞的癌细胞发生迁移与侵袭[15]。乳腺癌细胞中RAB23可上调表达且与乳腺癌细胞增殖及转移紧密相关。Bin等[16]研究表明胃癌组织中RAB23上调表达且可参与胃癌细胞系Hs746T及SGC7901的侵袭及转移过程。关于RAB23在食管鳞癌组织中的表达水平研究相对较少，因而本研究通过qRT-PCR法检测RAB23在食管鳞癌组织及癌旁组织中的表达水平，结果显示研究组患者RAB23 mRNA表达水平显著高于对照组，且免疫组化结果显示食管鳞癌组中RAB23蛋白阳性表达显著高于对照组，说明食管鳞癌组织中RAB23呈高表达，RAB23表达与食管鳞癌的发生、发展有关。

临床病理参数分析结果显示，RAB23与淋巴结转移、TNM分期及组织分化程度显著相关，TNM分期为Ⅰ～Ⅱ期时RAB23阴性表达率较高，而Ⅲ～Ⅳ期时RAB23阳性表达率较高，说明随着淋巴结的转移、TNM分期变化及组织分化，食管鳞癌组织中RAB23表达随之升高。Kaplan-Meier曲线显示，RAB23阴性表达组PFS、OS均显著高于阳性表达组，说明RAB23阳性表达与食管鳞癌患者预后紧密相关。推测RAB23可作为早期诊断及评估患者预后的辅助指标。研究表明miR-802可通过上调靶基因RAB23表达进而参与胃癌细胞的增殖及迁移[17]。本研究通过Pearson法对miR-802与RAB23进行相关性分析，结果显示二者呈负相关，说明miR-802可通过调控靶基因RAB23的表达进而参与食管鳞癌发生及病情进展过程。本研究结果揭示miR-802、RAB23表达水平可判断食管鳞癌患者的疾病严重程度，并对早期诊断及评估患者预后均具有重要参考价值。

综上所述，食管鳞癌组织中miR-802下调表达，RAB23上调表达，二者呈负相关，且均与患者病情进展及预后有关，二者均可能为临床早期判断患者病情及评估预后的重要分子标志物。miR-802与RAB23是否为负调控模式及其内在机制有待进一步研究。