中药及天然产物单分子组分抗肿瘤免疫机理

王靳，李丹，李斌

上海交通大学 医学院 上海市免疫学研究所，上海 200025

美国癌症研究协会(AACR)2018年的癌症进展报告显示，自1990年以来美国癌症总体死亡率持续下降，1991—2014年期间仅美国就有240万癌症患者存活。逐渐上升的肿瘤五年存活率离不开活跃的基础科研。自从2013年肿瘤的免疫疗法被Science杂志评为十大科学进展之首，肿瘤免疫就开始从基础研究走向公众视线。2018年诺贝尔生理学或医学奖颁发给本庶佑(Tasuku Honjo)和詹姆斯•艾利森(James P. Allison)，他们的研究发现并推动了一种抑制负向免疫调节的癌症疗法。传统的化疗和放疗方法很大程度上无法区别肿瘤细胞与正常细胞，致使无差别的细胞死亡，而免疫疗法主要通过激活自身免疫系统，特异性地清除肿瘤细胞。现有的免疫疗法主要包括树突状细胞疫苗、免疫检查点抑制剂、嵌合抗原受体T细胞疗法(CAR-T)、溶瘤病毒等。

中医是中华民族的传统医学，善于从整体出发诊疗疾病。中医对于肿瘤的治疗可概括为“清热祛毒”“扶正固本”“活血化瘀”“消痰散结”四方面[1]。扶正固本又称固本培正，与免疫疗法的概念有大面积重叠，即提高自身免疫力，调节血液和肿瘤微环境中免疫细胞的功能，促进免疫细胞释放促炎性细胞因子，利用免疫细胞杀伤肿瘤细胞。目前，中药抗肿瘤领域已经取得了大量的临床数据，临床试验证明中药在癌症复发和转移的治疗和预防中发挥作用，可显著延长肿瘤患者术后生存时间[2-3]。由于中成药成分复杂，很多情况下难以确定其主要活性成分，当前的研究主要针对中药中单一成分提取物或单分子，故本文围绕中药单分子或提取物来讨论其在抗肿瘤免疫中发挥的作用。

1 中药调节固有免疫抗肿瘤

根据能否特异性识别病原体，可将免疫系统分为固有免疫和适应性免疫两部分。固有免疫由皮肤、黏膜和固有免疫细胞三部分组成。又可以根据形态、颗粒度、趋化性以及行使的功能，将固有免疫细胞分为中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、巨噬细胞、树突状(DC)细胞、自然杀伤(NK)细胞等。固有免疫细胞在肿瘤微环境中发挥多重作用，包括但不限于促进炎症反应，免疫抑制，参与肿瘤血管形成。中药可活化特定的固有免疫细胞，通过增强抗原提呈或细胞免疫过程来杀伤肿瘤细胞，也可以通过抑制某些固有免疫细胞如肿瘤浸润巨噬细胞的活性，抑制肿瘤微环境中血管的形成以及肿瘤的转移和复发。

1.1 通过促进树突状细胞成熟促进抗肿瘤免疫

树突状细胞(DC)来源于骨髓的CD34+造血干细胞，1973年由Steinman及其同事首次发现并进行描述[4]，是已知最有效的抗原提呈细胞。存在于血液或淋巴组织中的未成熟树突状细胞寻找并吞噬病原体，将其抗原暴露；已成熟并携带抗原的树突状细胞在次级淋巴组织将抗原肽呈递给淋巴细胞，并激活幼稚T细胞。1992年Inaba和Steinman证明小鼠树突状细胞可以从骨髓前体离体培养[5]，为树突细胞疫苗的产生埋下伏笔。树突状细胞疫苗主要制备流程：从患者去除淋巴细胞和白细胞的外周血单个核细胞中分离培养未成熟树突状细胞，加入细胞因子TNF-α等刺激树突状细胞成熟，将设计好的多肽片段作为抗原加载到成熟的树突状细胞上，通过皮下注射回输至患者体内，促进抗肿瘤免疫应答[6]。

中药能够促进树突细胞的成熟，从而通过增加促炎性细胞因子的分泌和共刺激因子的表达来增强免疫应答反应。胡玉平等发现牡丹皮提取物丹皮酚能够通过诱导树突状细胞成熟，刺激树突状细胞分泌细胞因子来提高树突状细胞的抗原提呈与激活能力[7]，具体表现为丹皮酚处理过的树突状细胞表面MHC-II类分子、CD40和CD60的表达量增加，促炎性细胞因子IL-12的分泌增加，且分泌量呈现剂量依赖关系。枸杞中的主要活性成分枸杞多糖可上调树突状细胞表面激活标志物CD11c表达，通过 TLR2/TLR4 介导的NF-κB通路诱导 DCs 成熟。枸杞多糖处理过的树突状细胞能够更有效地促进淋巴细胞的激活和增殖，强化免疫应答反应[8]。因此，将中药作为树突状疫苗的辅助治疗手段，可以取得更好的临床治疗效果。

1.2 提高自然杀伤细胞毒性促进抗肿瘤免疫

NK细胞兼具识别和消灭肿瘤细胞的功能。正常的细胞表面高表达MHC-I类分子，肿瘤细胞表面的MHC-I类分子表达量变低或发生改变。NK细胞可及时检测细胞表面MHC-I类分子的改变，判断其是否为恶性肿瘤细胞，接着通过两种方式(图1)清除肿瘤细胞：NK细胞表面的Fc受体识别肿瘤细胞表面由IgG包被的肿瘤抗原，紧接着释放颗粒酶B和穿孔素裂解肿瘤细胞，这一途径被称为抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)；或者通过自身细胞表面的天然细胞毒性受体(NCR)与肿瘤细胞表面的抗原结合，活化的NK细胞裂解肿瘤细胞[9]。除了识别并消灭肿瘤细胞外，NK细胞还能够帮助肿瘤特异性的CD4+、CD8+T细胞形成及应答[10]。在鳞状细胞肺癌、结直肠癌及胃癌的研究中发现，肿瘤局部NK细胞的比例越高，患者预后越好[11]。

图1 NK细胞通过两种方式杀伤肿瘤细胞

枸杞多糖可以增加NK细胞表面受体NKp30的表达，促进IFN-γ和穿孔素的分泌，使细胞毒性显著增加[12]。秦韬等将NK细胞与树突状细胞共同孵育后使用羟乙基化猴头菇多糖处理，发现猴头菇多糖和羟乙基化猴头菇多糖均能够协同NK细胞使DC细胞IL-12、IL-15、IL-18、NF-κB mRNA表达量显著提升，同时猴头菇多糖和羟乙基化猴头菇多糖也能够协同DC细胞使NK细胞中NKG2D、TNF-α、IFN-γ和GM-CSF的 mRNA 表达增加，增强NK细胞与DC细胞之间的相互作用，提高免疫活性[13]。多酚类化合物白藜芦醇在抗肿瘤领域中也发挥着独特的作用。白藜芦醇广泛存在于葡萄、藜芦、虎杖等植物中，对免疫系统有双重调节功能，被证实具备多方面的抗癌作用。在体外使用低浓度的白藜芦醇(0.33～5.48 μmol/L)处理NK细胞后，NK细胞杀伤活性增加，且其杀伤能力与白藜芦醇存在浓度依赖型双相效应[14]。另一种天然产物，韩国槲寄生凝集素，被证实可以促进免疫反应。韩国槲寄生凝集素在体外可通过激活NK细胞表面受体NKG2D来促进JNK磷酸化，JNK-STAT信号传导通路被激活，最终导致NK细胞中穿孔素表达增加，NK细胞对于肿瘤细胞的杀伤活性增强[15]。存在于紫草中的萘醌化合物紫草素能够促进NK细胞的增殖，并且以剂量依赖方式促进NK细胞中穿孔素和颗粒酶B的表达，增强其对结肠癌细胞的毒性[16]。

图2 巨噬细胞促进肿瘤微环境中血管生成

1.3 抑制肿瘤浸润巨噬细胞的极化

同属于固有免疫细胞的巨噬细胞在抵御病原体、维持组织稳态方面发挥着广泛的功能。巨噬细胞可被广泛地分为两类：经典活化型M1(classical M1)和选择性活化型M2(alternative M2)。其中，M1型巨噬细胞高表达促炎因子IL-6、I-10、IL-23和肿瘤坏死因子TNF-α，功能包括促炎、清除病原体、抗肿瘤免疫等；M2型巨噬细胞的功能包括抗炎，参与伤口愈合和原发性肿瘤的形成。存在于肿瘤微环境中的肿瘤相关巨噬细胞(Tumor associated macrophage，TAM)的表型更倾向于M2型巨噬细胞：高表达抑炎因子IL-10，低表达促炎因子IL-12。TAM参与抗炎、免疫抑制和肿瘤血管形成等过程(图2)，通过分泌生长和蛋白水解酶来调节肿瘤微环境，促进肿瘤细胞的侵袭[17]。巨噬细胞向肿瘤微环境中浸润通常与疾病进展有关。临床数据显示，乳腺癌晚期(III+IV)肿瘤患者的TAM密度显著高于早期患者(I+II)。在子宫内膜癌、泌尿生殖系统癌症、前列腺癌、膀胱癌、卵巢癌患者中，TAM的密度与总体生存期(OS)存在显著相关性[18]。

中药可以抑制TAM的M2样极化，阻滞肿瘤的生长、迁移。有学者研究发现，蓼科植物大黄、虎杖的根茎提取物大黄素可通过靶向抑制IRF4、STAT6、5CEBPβ信号传导过程来抑制TAMs的M2样极化，减少乳腺癌细胞中趋化因子MCP-1和巨噬细胞集落刺激因子CSF-1的分泌，从而减少巨噬细胞向肿瘤组织的迁移。大黄素能够阻断乳腺癌细胞与TAMs间的前馈回路，减少巨噬细胞向肿瘤组织浸润和M2样巨噬细胞的活化。大黄素还可以降低TAMs中黏附分子ICAM-1的表达和乳腺癌细胞膜表面糖蛋白Thy-1的表达，阻断两种细胞类型之间的黏附，抑制乳腺癌的生长和转移[19]。肿瘤微环境中血管生成除了滋养肿瘤细胞、促进其生长外，也与肿瘤的转移密切相关。香菇多糖是从香菇中提取得到的具有生物活性的化合物，香菇多糖能够促进血管生成抑制因子IFN-γ的表达，从而抑制肿瘤血管生成[20]。

2 中药调节适应性免疫抗肿瘤

适应性免疫为脊椎动物所特有，具备三个特点：特异性、多样性、记忆性。依据功能可将适应性免疫细胞划分为辅助性T细胞(Th cells)、调节性T细胞(Treg cells)、细胞毒性T细胞(cytoxic T cell，CTL)和B细胞四大类。CAR-T细胞疗法、免疫检查点阻断剂的概念均来源于对淋巴细胞分子层面的探索。目前，中药单分子调节适应性免疫方面的研究已经深入到对于某一特定信号通路的阻断/激活，从而激活或抑制某类免疫细胞。

2.1 促进淋巴细胞增殖活化

前文已经提到，肿瘤细胞的表面抗原有别于正常细胞，携带相应受体的T细胞可以据此识别肿瘤细胞，负责这一过程的是细胞毒性T细胞。细胞毒性T细胞可在辅助性T细胞的帮助下特异性地识别并杀伤肿瘤细胞。CAR-T疗法就是针对肿瘤表面的特异性抗原，体外改造T细胞受体，增强其特异性，达到更好的抗肿瘤效果。

研究尚未发现能够显著提高T细胞特异性的中药单分子，但已发现在体外人参皂苷Rg1可以促进CD4+T细胞的激活，增加IL-4 mRNA的转录从而促进幼稚CD4+细胞向Th2细胞的分化，并且在Rg1刺激下，CD4+T细胞分泌的IL-2上升[21]，起到增强免疫反应的作用。

值得注意的是，淋巴细胞活性过强也会导致机体损伤。CAR-T治疗期间由于细胞因子释放综合症(CRS)引发的高热、神经系统异常、低血压等不良反应[22]使得CAR-T细胞疗法适用人群受到限制，因而下一步研究需要针对这一问题寻找对应的中药，削弱细胞因子诱导产生的副作用，解决CAR-T治疗中的副反应问题。

2.2 解除免疫抑制促进免疫应答

增强T细胞的杀伤活性、提高T细胞的特异性还不够，肿瘤细胞还存在着独特的逃逸机制。肿瘤细胞表面存在着一类独特的抗原，被T细胞识别后可诱导T细胞失活，如肿瘤表面的PD-L1与其配体PD-1结合后，可通过抑制PI3K-AKT-mTOR通路损害T细胞的代谢重编程。针对免疫检查点开发出的阻断剂Opdivo、Keytruda等实则为抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体。这些靶向药物与肿瘤细胞表面的PD-L1或T细胞表面的PD-1竞争性结合靶位点，使得PD-1与PD-L1无法正常结合，T细胞能够持续激活并行使杀伤功能。假如肿瘤表面的PD-L1表达减少，也可以让T细胞的激活过程免受负向调节(图3)。中药雷公藤中的雷公藤甲素被发现能够抑制人乳腺癌细胞表面由IFN-γ诱导的PD-L1表达，通过下调PD-1/PD-L1通路，激活T细胞的肿瘤免疫活性[23]。

除了肿瘤细胞表面的抑制性受体介导肿瘤免疫耐受，调节性T细胞同样能够抑制肿瘤免疫。同细胞毒性T细胞一样，Treg细胞被趋化因子CCL12等招募到肿瘤部位，通过分泌抑炎性细胞因子、接触抑制等方式抑制CTL活性。与M2型巨噬细胞相似，Treg细胞能够抑制Th1细胞释放细胞因子，促进肿瘤微环境中的血管生成[24]。此外，由于肿瘤组织的缺氧微环境，Treg细胞促进细胞凋亡基因的表达量增加，抑制细胞凋亡基因的表达量降低。凋亡过程中的Treg细胞释放大量ATP，由CD39/CD73通路转化为腺苷释放，被CTL细胞膜表面的腺苷受体A2a结合、识别后抑制CTL细胞活性[25]从而抑制抗肿瘤免疫。

Treg细胞的标志性分子——叉头状转录因子3(FOXP3)，它的正常表达是Treg细胞维持免疫耐受功能的关键因素，转录水平可以决定Treg的功能。雷公藤甲素能够降低淋巴细胞中FOXP3的转录水平，降低血液中Treg细胞比例[26]。传统中药玉屏风散中的活性成分——黄芪多糖可以通过恢复细胞因子失衡，降低FOXP3在肝细胞癌局部肿瘤微环境中的表达来抑制CD4+CD25highTreg细胞的生长和增殖。黄芪多糖可能通过阻断SDFF-1与其配体的结合来抑制CXCR4/CXCL12通路，防止Treg向肿瘤微环境中迁移[27]。

近年来，对于FOXP3蛋白翻译后修饰的研究表明，上调或下调FOXP3蛋白甲基化、乙酰化、泛素化等表观水平修饰会影响Treg细胞的免疫抑制功能。笔者所在的课题组分别于2013年和2016年发现，FOXP3 蛋白泛素化相关的酶类Stub1 能够促进 FOXP3 的 K48 连接的泛素化修饰并导致其蛋白降解[28]；去泛素化酶USP7 和 USP21 可通过去泛素化作用稳定 FOXP3，从而增强Treg细胞的功能[29]。研究发现，PIM1也能够介导FOXP3磷酸化，影响Treg的免疫抑制活性[30]。

大量数据支持长期慢性炎症与胃肠道肿瘤风险增加有关[31]。尽管Treg细胞的的免疫抑制功能阻止了抗肿瘤免疫应答，但其抑炎功能可以防止慢性炎症向癌症的转变。从藤黄属植物山木瓜中提取得到的小分子化合物Cambogin能够通过去泛素化酶USP7稳定FOXP3蛋白，从而使Treg细胞发挥免疫抑制功能，抑制结肠炎的疾病进展[32]。山柰酚是一种天然黄酮类化合物，广泛存在于茶叶、西兰花、翠雀草、金缕梅、葡萄柚、苹果等植物中。作为PIM1的抑制剂，山柰酚能够通过抑制FOXP3磷酸化来增强FOXP3+Treg细胞的抑制能力；此外，山柰酚能够增加Treg细胞中的FOXP3表达水平，改善由胶原诱导的关节炎大鼠模型的病理情况[33]。

未来对于中药小分子的研发也可从Treg细胞特征蛋白的翻译后修饰入手，通过上调或下调其免疫抑制功能，如使用PIM-1抑制剂等手段[34]，促进抗肿瘤免疫。

图3 PD-1抑制T细胞活性原理与PD-1抑制剂的作用机制

3 小结与讨论

中医是上千年经验医学的集成，对于使用动植物提取物治疗疾病有着独特的见解。天然化合物与经验医学的结合往往给人带来惊喜，目前的主流抗癌药物喜树碱、长春新碱、紫杉醇最初分别从喜树、长春花、红豆杉中提取和分离得到。我们应当继续从典籍记载具有特殊功效的方剂中发掘更多成分明确、机理清楚的中药提取物或小分子，再针对中医在癌症治疗过程中的优势和特点，将中医作为癌症辅助治疗的手段，在临床中实现更好的肿瘤治愈率。