白藜芦醇对衰老小鼠脑神经细胞的保护机制

张贤益，宋也好，李 露，尹术华，付王威，吴睿婷，潘 猛，吴文英，汤小芳，李文娟*

（南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047）

衰老是一种由多因素决定的涉及多器官的自然生理过程，而脑衰老是机体衰老过程中常见的生理现象，其在机体健康与疾病的平衡中扮演着重要角色[1-2]。近年来，由于机体衰老而导致的脑疾病发病率逐年升高，而我国老龄人口数量庞大，截至2014年底我国60 岁及以上人口约占总人口的16%，老年群体的脑衰老疾病给我国经济、社会、家庭带来了沉重负担[3]，因此，加强对脑衰老的研究具有重要的现实意义。白藜芦醇（resveratrol，RSV）即3,4',5-三羟基反式二苯乙烯，是一种具有顺、反2 种结构的非黄酮类植物多酚[4]，其主要存在于葡萄、花生、桑树等植物中，因具有抗衰老、抗氧化、抗癌等多种重要活性而成为研究热点[5-6]。脑神经细胞是组成脑神经系统的基本功能单位，其正常的生长、发育、分化是维持大脑功能的基础[7]；而在机体衰老过程中，神经细胞的凋亡会日益增加，导致线粒体功能紊乱。Brenowitz等[8]研究发现，在脑神经细胞凋亡过程中活性氧（reactive oxygen species，ROS）会过度积累，线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential，MMP）显著降低，此变化标志着线粒体功能损伤明显[9]；Guo Xiaoqian等[10]发现，损伤的线粒体在机体衰老过程中会通过Bcl-2家族成员促进凋亡因子释放来加速细胞凋亡和机体衰老；Geng Huixia等[11]发现线粒体在神经细胞凋亡过程中通过释放细胞色素c（cytochrome c，Cyt c）与凋亡蛋白诱导因子pro-Caspase-9等结合形成凋亡复合体，促进Caspase家族蛋白酶活化，弱化线粒体功能，促使脑神经细胞凋亡[12-13]，最终导致脑记忆减退、神经衰弱，甚至诱使机体发展成阿尔茨海默病等相关疾病[14]。因此，加强对RSV的脑神经细胞保护作用研究具有重要意义。本研究利用D-半乳糖（D-galactose，D-gal）建立小鼠衰老模型[15]，检测RSV对小鼠体质量、脑器官指数、脑记忆水平、神经细胞凋亡、ROS水平、MMP变化、线粒体Caspase-9和Caspase-3活力、线粒体Cyt c和胞浆Cyt c表达情况的影响，探究RSV是否通过线粒体机制对衰老小鼠脑神经细胞产生保护作用。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

BALB/c清洁级小鼠60 只，雌雄不拘，6～8 周，体质量（30±2）g，购自江西中医药大学。生产许可证号：SCXK（赣）2006-0001。

D-gal、RSV、罗丹明123 美国Sigma公司；2',7'-二氯荧光素二乙酸酯（2',7'-dichlorofluorescein dilacerate，DCFH-DA） 美国Molecular Probes公司；Cyt c抗体美国BD Pharmingen公司；Annexin V试剂盒（含碘化丙啶（propidium iodide，PI）） 法国国际免疫公司；Caspase-3、Caspase-9试剂盒 美国BioVision公司；生理盐水、磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）为自制。

1.2 仪器与设备

Mettler Toledo AL104电子天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；3K15冷冻离心机 德国Sigma公司；SHP-150生化培养箱 上海森信实验仪器有限公司；FACSCaliburTM流式细胞仪 美国Becton Dickinson公司；－80 ℃超低温冰箱 美国Thermo Scientific公司；超净工作台 苏净集团安泰公司。

1.3 方法

1.3.1 实验分组、模型建立、RSV处理

实验条件及分组：小鼠于18～22 ℃、相对湿度50%～60%条件下饲养，12 h昼夜交替，自由摄食和饮水。实验中严格遵守动物管理条例和伦理委员会鉴定许可，垫料、饲料、饮水均符合使用标准。小鼠按照体质量均分为5 组：Control组、D-gal组、D-gal＋RSV（6.25）组、D-gal＋RSV（12.5）组、D-gal＋RSV（25）组。每组12 只，编号。

模型建立：除Control组外，其他各组每日按100 mg/kg mb腹腔注射D-gal，Control组按相同剂量注射生理盐水，持续10 周，建立小鼠衰老模型。

RSV处理：从第7周开始，3 个RSV处理组分别按6.25、12.50、25.00 mg/kg mb灌胃RSV，其他组按100 mg/kg mb灌胃生理盐水，持续4 周，第10周结束后处死小鼠。

1.3.2 脑神经细胞的制备

参照文献[16]的方法。无菌摘除小鼠大脑置于预冷的生理盐水中，分离大脑皮质，称质量，将大脑皮质剪碎，于37 ℃条件下加入1.25 mg/mL胰酶消化8 min，胎牛血清终止消化；接着采用全培养基（Dulbecco's modified eagle medium，DMEM）培养神经细胞，再将细胞悬浮培养在含胎牛血清的DMEM培养基中，再分别加入100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素，同时在37 ℃、5% CO2、饱和湿度的条件下培养细胞，细胞浓度不超过5×105个/mL，每日换液以维持细胞良好状态，待后续实验使用。

1.3.3 指标检测

脑器官指数：取出小鼠脑组织用生理盐水清洗后并称质量。脑器官指数按下式计算。

记忆水平：参照Morris等[17]的方法，采用圆形水池和隐藏平台制成简易水迷宫。实验中水面高出平台约1 cm，水温为（22.0±0.5）℃，将水染成黑色以隐藏平台。将小鼠放入水池中自由游泳，记录120 s内小鼠找到平台的时间；如果120 s内小鼠未找到平台，将其引至平台并停留20 s以加强记忆，每天训练4 次，共训练4 d，第5、6天撤去平台，记录120 s内小鼠穿越原平台所在位置的次数以评价RSV对衰老小鼠记忆水平的影响。

细胞凋亡率[18]：在室温下加入250 μL 1.25 mg/mL胰酶处理神经细胞，10 min后用DMEM培养基终止消化，收集神经细胞于离心管，2 000 r/min离心5 min，收集沉淀细胞，PBS洗涤2 次，加入适量胰蛋白酶抑制剂和RNA酶缓冲液，在室温下反应10 min；然后加入Annexin V和PI染色液各5 μL，避光反应5 min，冰浴10 min，在流式细胞仪中进行测定。

细胞R O S水平：以2',7'-二氯荧光素（2',7'-dichlorofluorescein，DCF）的荧光强度表示细胞内ROS水平，荧光强度越强表明ROS水平越高[19]。以DCFH-DA作为ROS特异荧光探针并检测其水平。取1.3.2节生长状况良好的神经细胞加入0.5 mL 20 μmol/L DCFH-DA，在37 ℃、避光条件下孵育，20 min后移去培养基，PBS漂洗细胞3 次，在激发光波长525 nm下使用流式细胞仪检测细胞内ROS水平。

细胞MMP：根据线粒体摄取Rho123荧光染料后可发出绿色荧光，其强度与MMP成正相关的工作原理[20]，取1.3.2节生长状况良好的细胞，用含乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）的胰酶消化，并用PBS漂洗2～3 次制成细胞悬液，在4 ℃、1 500 r/min条件下离心10 min，再避光加入0.5 mL 5 mg/L Rho123染液置于培养箱中染色30 min，PBS漂洗1 次；在4 ℃、1 500 r/min条件下离心10 min，过200 目尼龙滤网，使用流式细胞仪在激发波长488 nm、发射波长530 nm条件下检测Rho123的荧光强度。

细胞Caspase-9和Caspase-3活力：严格按照试剂盒说明书操作，测定Caspase-3和Caspase-9活力。调节细胞浓度至2×105～5×105个/mL，冰浴10 min，1 000 r/min离心1 min后测定蛋白质浓度，加入50 μL细胞裂解液将蛋白样品稀释至100 μL，每个样品中分别加入2×缓冲液（50 μL）和4 mmol/L LEHD-pNA底物（5 μL），再于37 ℃温育1 h。同时，将未诱导的细胞设为阴性对照组，通过比较RSV处理组与Control组水平以测定Caspase-9和Caspase-3活力。

Western blotting法检测Cyt c表达：取待用细胞悬液，PBS漂洗3 次，按体积比1∶8加入匀浆液进行匀浆，在4 ℃、1 000 r/min条件下离心10 min，取上清液，在4 ℃、3 000 r/min条件下离心15 min，继续取上清液，在4 ℃、10 000 r/min条件下离心15 min，分装上清液，进行冻存[21]。按照Bradford法测定蛋白质量浓度，再严格按照Western blotting方法配制质量分数15%分离胶、3%浓缩胶，于每个上样孔中加入20 μg蛋白样品，在150 V电压下电泳30 min；再在100 V电压下分别电转移15、30、60、90、120 min，将硝酸纤维素膜浸入1%丽春红溶液中显色3 min后用蒸馏水冲洗；最后将膜浸入质量分数1% Tween 20、5%脱脂乳粉中封闭1 h，加入按1∶300体积比稀释的Cyt c抗体，4 ℃孵育过夜，用TBST（Tris buffered saline Tween）洗膜3 次后加入按1∶2 000体积比稀释的二抗，室温孵育1 h，TBST洗膜3 次后进行电化学发光（electro-chemiluminescence，ECL）显色[22]。

1.4 数据统计与分析

2 结果与分析

2.1 RSV对小鼠体质量的影响

表1 RSV对小鼠体质量的影响Table 1 Effect of RSV on body mass in mice

体质量是机体生长发育的一个重要指标，其变化能反映小鼠的生长情况。实验周期内每周相同时间称量并记录一次小鼠体质量。由表1可知，各组小鼠在实验初期的平均体质量基本相同，组间无显著差异（P＞0.05），在第7周进行RSV灌胃后，由于灌胃操作可能会对胃肠黏膜造成损害，导致小鼠食欲低下，体质量短时间内小幅下降，适应本操作后小鼠体质量又有所增长，说明RSV的剂量在本实验周期内未对小鼠体质量造成影响，不影响实验小鼠的正常生长发育。

2.2 RSV对小鼠脑器官指数的影响

表2 RSV对小鼠脑器官指数的影响Table 2 Effect of RSV on brain index in mice

脑器官指数能反应脑组织的健康状况，与脑组织的健康程度呈正相关。由表2可知，与Control组相比，D-gal组小鼠脑器官指数明显减小，且具有显著性差异（P＜0.05），表明D-gal对小鼠脑组织造成明显损伤。而与D-gal组相比，RSV处理组脑器官指数均有不同程度的提高，其中D-gal＋RSV（25）组效果最为明显，与D-gal组具有显著性差异（P＜0.05）。此结果表明RSV能提高D-gal致衰老小鼠的脑器官指数，对脑组织具有保护作用。

2.3 RSV对小鼠记忆水平的影响

表3 RSV对小鼠穿越隐藏平台次数的影响Table 3 The effect of RSV on the number of crossing platform in mice

由表3可知，与Control组相比，D-gal组小鼠穿越隐藏平台的次数明显减少，表明D-gal能使小鼠记忆水平降低，损伤记忆功能；与D-gal组相比，RSV处理组小鼠穿越隐藏平台次数均有所提高，但无显著差异（P＞0.05），结果表明RSV在一定程度上能提高D-gal致衰老小鼠的记忆水平，改善记忆功能。

2.4 RSV对脑神经细胞调亡的影响

图1 RSV对D-gal诱导小鼠大脑皮质神经细胞凋亡的影响Fig. 1 Effect of RSV on D-gal-induced apoptosis of cerebral cortical neurons in mice

由图1可知，与Control组相比，D-gal组小鼠脑神经细胞凋亡率由3.66%增加至37.99%，存在极显著差异（P＜0.01），说明D-gal引起脑神经细胞凋亡明显，所造衰老模型成功。而与D-gal组相比，RSV处理组小鼠脑神经细胞凋亡率分别降至28.32%、21.38%、18.56%，均有极显著差异（P＜0.01），且抑制效果与RSV剂量呈正相关，表明RSV对D-gal致衰老小鼠脑神经细胞凋亡具有抑制作用。

2.5 RSV对脑神经细胞ROS水平的影响

由图2可知，与Control组相比，D-gal组DCF荧光强度由105.64±5.20增加至155.88±13.77，差异极显著（P＜0.01），说明D-gal组小鼠脑神经细胞ROS积累明显；而与D-gal组相比，D-gal＋RSV（6.25）、D-gal＋RSV（12.5）、D-gal＋RSV（25）组DCF荧光强度分别减至121.48±9.35、92.56±8.71、87.67±15.43，均有极显著差异性（P＜0.01），且其DCF荧光强度与RSV呈剂量依赖性相关，表明RSV能够有效抑制D-gal致衰老小鼠脑神经细胞中ROS的积累。

图2 RSV对D-gal诱导小鼠脑神经细胞ROS相对含量的影响Fig. 2 Effect of RSV on ROS production in cerebral cortical neurons of aging mice induced by D-gal

2.6 RSV对脑神经细胞MMP的影响

图3 RSV对D-gal诱导小鼠脑神经细胞线粒体膜电位的影响Fig. 3 Effect of RSV on MMP in cerebral cortical neurons of aging mice induced by D-gal

由图3可知，Control组Rho123荧光强度最强，而D-gal组Rho123荧光强度最弱，两者之间具有极显著性差异（P＜0.01），结果显示D-gal能使小鼠脑神经细胞MMP极显著降低，造成线粒体损伤。而与D-gal组相比，D-gal＋RSV（6.25）、D-gal＋RSV（12.5）、D-gal＋RSV（25）组Rho123荧光强度均有极显著增强（P＜0.01），且MMP的增强效果与RSV剂量呈正相关。此结果说明RSV可促进D-gal致衰老小鼠脑神经细胞MMP增强，对线粒体具有保护作用。

2.7 RSV对脑神经细胞线粒体凋亡途径的影响

由图4可知，与Control组相比，D-gal组线粒体Cyt c表达下降，胞浆Cyt c表达增强；而与D-gal组相比，RSV处理组线粒体Cyt c表达均增强，胞浆Cyt c表达均降低；表明RSV可显著促进D-gal致衰老小鼠脑神经细胞中线粒体Cyt c的表达，抑制胞浆Cyt c的表达。

另一方面，与Control组相比，D-gal组线粒体中Caspase-9和Caspase-3活力极显著上升（P＜0.01）；表明D-gal组Caspase家族蛋白酶已被活化。而与D-gal组相比，RSV处理组中Caspase-9和Caspase-3活力均极显著降低（P＜0.01），且与RSV剂量呈正相关。说明RSV可有效抑制脑神经细胞中Caspase-9和Caspase-3活化，对线粒体产生保护作用，从而有效抑制D-gal致衰老小鼠脑神经细胞凋亡。

图4 RSV对D-gal诱导小鼠脑神经Cyt c表达及对Caspase-9和Caspase-3活力的影响Fig. 4 Effect of RSV on the expression of cytochrome c and the activity of caspase-9 and caspase-3 in cerebral cortex of D-gal-induced aging mice

综上可知，对D-gal致衰老小鼠灌胃RSV 4 周后，RSV能抑制D-gal引起的线粒体凋亡通路相关参数Cyt c表达和Caspase-3、Caspase-9活力的变化，表明RSV通过线粒体通路来抑制D-gal致衰老小鼠脑神经细胞的凋亡。

3 讨 论

机体在衰老过程中易引起线粒体功能损伤、代谢紊乱、自由基过剩等，最终导致细胞凋亡。因细胞凋亡与机体衰老过程中组织、器官功能的退化以及老年痴呆等疾病的发生密切相关，所以细胞凋亡会加速机体衰老，因此神经细胞凋亡也是导致机体衰老的一个重要因素[23-24]。神经细胞是组成神经系统基本单位，在机体衰老过程中，脑神经细胞逐渐发生坏死或凋亡，从而出现记忆损伤、意识模糊等病症[25]。D-gal致衰老模型是指对动物长期注射适宜剂量D-gal使其产生一系列与衰老相关的病理过程。本研究通过连续10 周腹腔注射D-gal建立小鼠衰老模型，再对小鼠灌胃不同剂量的RSV并以脑神经细胞凋亡作为研究重点，探究RSV对衰老小鼠脑神经细胞的保护作用及线粒体机制[26]。

结果显示，与Control组相比，D-gal组脑器官指数显著减小（P＜0.05），记忆能力有所降低，但无显著差异（P＞0.05），脑神经细胞凋亡率极显著增加（P＜0.01），表明实验周期内D-gal能加速小鼠脑损伤，促进脑神经细胞凋亡。而经RSV处理4 周后，与D-gal组相比，RSV 3 个剂量组中脑器官指数增大，其中D-gal＋RSV（25）组效果最明显（P＜0.05）；记忆能力均有增强，但无显著差异（P＞0.05）；神经细胞凋亡率极显著降低（P＜0.01），表明RSV能有效保护脑组织，抑制脑神经细胞的凋亡。在RSV的线粒体作用通路研究中，利用流式细胞仪检测DCF和Rho123的荧光强度，测定脑神经细胞ROS水平和MMP的变化，结果显示，与Control组相比，D-gal组小鼠脑神经细胞ROS积累极显著增加（P＜0.01），MMP极显著降低（P ＜0.01），表明D-gal加速了脑神经细胞损伤；而与D-gal组相比，RSV 3 个剂量组中ROS水平均极显著降低（P＜0.01），MMP均极显著增加（P＜0.01），结果表明RSV能抑制ROS积累，提高MMP，对脑神经细胞产生保护作用，此结果与Baar等[27]研究结果一致。在细胞凋亡过程中，先出现MMP下降，再发生胞膜磷脂酰丝氨酸由内而外的转变，导致Caspase家族成员被激活，其也是细胞凋亡的早期表现[28]，且当膜电位下降时，细胞凋亡不可逆转，因此MMP下降也是细胞凋亡的特征表现，此结果与Sung等[29]的研究结果一致。

与Control组相比，D-gal组线粒体Cyt c表达下降，胞浆Cyt c表达增强；而与D-gal组相比，RSV 3 个剂量组线粒体Cyt c表达回升，胞浆Cyt c表达降低，结果提示RSV可显著抑制D-gal致衰老小鼠神经细胞中Cyt c的表达，与Pradelli等[23]研究结果一致，他们发现凋亡蛋白促使线粒体损伤，而损伤的线粒体通过Cyt c诱导细胞凋亡。有研究显示，活化的Caspase-9和Caspase-3均会参与到细胞凋亡的过程中，促进细胞凋亡[30]。本研究检测了Caspase-9和Caspase-3活力，结果发现与Control组相比，D-gal组线粒体Caspase-9和Caspase-3活力极显著上升（P＜0.01）；而与D-gal组相比，RSV 3 个剂量组中Caspase-9和Caspase-3活力呈剂量依赖性极显著降低（P＜0.01），表明RSV可抑制D-gal致衰老小鼠脑神经细胞中Caspase-9和Caspase-3活性的升高。本研究中线粒体凋亡信号通路中3 个参数均发生变化，提示RSV可能通过调控线粒体通路来抑制脑神经细胞凋亡。

综上可知，RSV能明显抑制D-gal致衰老小鼠脑神经细胞损伤，提高小鼠脑器官指数和记忆水平，极显著降低细胞凋亡率、抑制ROS积累、提高MMP，说明RSV对D-gal致衰老小鼠脑神经细胞产生了保护作用；而RSV又能提高线粒体Cyt c表达，抑制胞浆Cyt c表达，极显著降低Caspase-9和Caspase-3活力，说明线粒体通路介导了RSV对D-gal致衰老小鼠脑神经细胞的保护作用。