2,4-表油菜素内酯对葡萄果实采后灰霉病的抑制作用机理

杨艺琳，张正敏，李美琳，赵立艳，金 鹏，郑永华*

（南京农业大学食品科技学院，江苏 南京 210095）

葡萄属于非呼吸跃变型果实，口味酸甜，营养价值高，是夏季最常食用的水果之一。夏季属于高温多雨季节，空气潮湿，加上运输、贮藏不当导致的果实表面机械损伤，容易使葡萄采后遭受病原菌的侵染，从而造成极大的经济损失。由灰葡萄孢（Botrytis cinerea）病原菌引起的灰霉病是葡萄果实采后最重要的病害之一[1]。控制葡萄灰霉病的传统方法是SO2熏蒸结合低温保藏法，但葡萄果实对SO2非常敏感，剂量稍不适宜，就容易发生漂白、风味劣变等伤害。除此之外，SO2容易在果皮表面残留，并对人体健康产生致癌和致畸的危害，过量的SO2进入空气中还会造成环境污染[2]。因此迫切需要研究葡萄果实非SO2处理的绿色保鲜技术。目前，国内外对采用各种激发子处理诱导提高果蔬的抗病性，从而控制采后病害发生的研究较为广泛。植物诱导抗病性主要有系统获得抗性（system acquried resistance，SAR）和诱导系统抗性两种形式[3]，按照作用机制诱导抗病性又可分为直接诱导作用和敏化反应（Priming）机制。Priming机制表现为植物经过激发子处理后不会直接展现任何可测的生理生化反应，而只在受到病原菌侵染后才展现出更强、更快的抗病防卫反应，包括活性氧迸发、病程相关蛋白（pathogensis-related protein，PRs）基因强烈表达等[4]。这样的防卫机制能够有效避免植物在未受到病原菌侵染因抵抗激发子胁迫产生抗病反应而导致的物质和能量消耗，因此是一种低成本、高效的抗病防御机制。近年来的研究发现，β-氨基丁酸（β-aminobutyric acid，BABA）和茉莉酸甲酯处理可有效诱导桃、杨梅、葡萄和樱桃等采后果实遭受病原菌侵染后的Priming抗病反应[5-8]。另有研究发现，γ-氨基丁酸处理也是通过Priming机制诱导提高梨果实抗病性，从而减少青霉病的发生[9]。

油菜素内酯（brassinosteroids，BRs）是一种天然的植物激素，在植物生长发育中起到至关重要的作用[10]，研究发现其对生物和非生物胁迫的抗性能够表现出独特的生物效应。在采后果蔬的研究中发现，外源BRs处理可以提高茄子[11]和草莓[12]果实的耐贮性和贮藏品质，减轻青椒[13]、桃[14]、杏[15]和香蕉[16]果实贮藏冷害的发生，但BRs处理对果实抗病性诱导作用的研究较少。Zhu Zhu等[17]发现5 μmol/L外源BRs处理可提高枣果实苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonialyase，PAL）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等几种抗病相关酶的活性，降低采后青霉病的发病率，且其对离体青霉菌没有直接的抑制作用。外源BRs处理也能够激活柑橘果实水杨酸诱导的SAR途径，表现为H2O2大量积累和PR基因显著表达，从而降低采后腐烂率并保持品质[18]。Liu Qing等[19]发现外源BRs处理对红地球葡萄采后灰霉病有显著的抑制作用，且能保持良好的贮藏品质，但BRs处理抑制葡萄采后灰霉病的作用机制仍不清楚。本实验以‘巨峰’葡萄为实验材料，采用2,4-表油菜素内酯（2,4-epibrassionolide，EBR）处理果实，研究EBR处理对葡萄果实采后灰霉病的抑制作用，并从抗病相关酶活力和抗病相关基因表达的角度探讨EBR诱导抗病的可能机理，为EBR处理在葡萄果实采后保鲜应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试材料为‘巨峰’葡萄果实（Vitis vinifera L. ×V. labrusca L. cv. ‘Kyoho'），2017年8月采摘于江苏省镇江市句容丁庄葡萄园，采后2 h内运回实验室。将果穗摊开后置于室温散去田间热，仔细剪下果粒并保留3～5 mm果梗，挑选色泽统一、成熟度一致、无机械损伤和病虫害的果粒以备实验。

病原菌B. cinerea来自实验室保存完好的斜面菌种，经PDA培养基分离纯化二代（每代26 ℃恒温培养14 d）后，用含体积分数0.01% Tween-80的无菌水冲洗平板稀释得到1×105个/mL浓度的孢子悬浮液（用血球计数板计数），置于4 ℃冰箱保存，现配现用。

EBR溶液配制：称取一定量EBR溶解于1 mL、体积分数98%乙醇溶液中，并加入一定量Tween-80，使其体积分数为0.1%，即得到母液，将母液进行梯度稀释即可得到所需浓度的EBR溶液，保证乙醇最终体积分数为0.1%。

EBR、L-苯丙氨酸、氮蓝四唑、核黄素、L-蛋氨酸、昆布多糖、十六烷基三甲基溴化铵（hexadecyltrimethy ammonium bromide，CTAB） 上海瑞永生物科技有限公司；几丁质、亚精胺、Tris 美国Sigma公司；β-巯基乙醇、四氯化钛、碳酸钠、3,5-二硝基水杨酸、硼酸、对二甲氨基苯甲醛、三水合乙酸钠 国药集团化学试剂有限公司；30% H2O2、福林-酚试剂、DEPC处理水 南京杰汶达生物科技有限公司；Prime ScriptTMRT Master Mix、SYBR®Premix Ex Taq™试剂盒 日本TaKaRa公司。

1.2 仪器与设备

UV-1600型分光光度计 上海美谱达仪器有限公司；H1850R型冷冻离心机 湖南湘仪离心机仪器有限公司；NanoDrop 2000分光光度计、SL 16R型冷冻离心机、MicroCL 21型微量离心机、QuantStudio™ 6 Flex实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR）系统 美国赛默飞世尔科技有限公司；MyCycler普通PCR仪 美国Bio-Rad公司；HWS-250型恒温恒湿培养箱、DK-S26型电热恒温水浴锅 上海森信实验仪器有限公司；BSA124S型电子天平 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；HZ-9211KB型恒温振荡器 太仓市科教器材厂；DYY-11型电泳仪 北京市六一仪器厂；CX22型光学显微镜 奥林巴斯（中国）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品处理

将挑选好的葡萄果粒整齐摆放在塑料白盒（330 mm×220 mm×60 mm）中，先用体积分数70%乙醇溶液对果实表面进行消毒，待乙醇挥发干净后用灭菌移液枪头在果实赤道中心部位穿刺打孔（直径1.5 mm、深2 mm），用吸水纸小心吸去流出汁液，然后将葡萄果实随机分成4 组进行以下处理：1）对照组：用移液枪注入20 μL无菌蒸馏水后，于25 ℃放置12 h；2）EBR处理组：用移液枪注入20 μL 5 μmol/L EBR溶液后，于25 ℃放置12 h（前期预实验采用0、1、5、10 μmol/L EBR溶液处理葡萄果实，然后接种灰霉病原菌，发现抑制葡萄果实腐烂最适宜的EBR处理浓度为5 μmol/L，故选用此浓度进行实验）；3）B. cinerea接种组：用移液枪注入20 μL无菌蒸馏水后，于25 ℃放置12 h，再用移液枪注入15 μL浓度为1×105个/mL的B. cinerea孢子悬浮液；4）EBR+B. cinerea接种组：用移液枪注入20 μL 5 μmol/L EBR溶液后，于25 ℃放置12 h，再接种15 μL 1×105个/mL的B. cinerea孢子悬浮液。4 组处理完成后，用两层聚乙烯保鲜膜密封白盒，置于25 ℃、相对湿度90%～95%的恒温恒湿箱中贮藏60 h，每隔12 h记录一次发病率和病斑直径，同时取除去发病组织的健康果肉，快速剁碎混匀后随机取一部分用液氮速冻后置于－80 ℃保存，作为qPCR样品用于测定基因表达；剩下部分用保鲜膜包成条状，用液氮速冻后置于－20 ℃保存，作为冻样用于测定酶活性等指标。重复3 次，每组约500 个果实。

1.3.2 指标测定

1.3.2.1 发病率及病斑直径测定

用游标卡尺测量葡萄果实接种部位病斑直径，大于1.5 mm则记为发病。发病率按下式进行计算。

1.3.2.2 体外孢子萌发率及芽管伸长长度测定

参照Wang Kaituo等[20]方法稍作修改，吸取200 μL B. cinerea孢子菌悬液，加入到含5 mL PDB培养液（含5 μmol/L EBR）的无菌玻璃管中，使病原菌孢子最终浓度为1×105个/mL，以不含EBR的作为对照管。将试管放入恒温摇床（25 ℃、100 r/min）中培养36 h，每隔12 h用CX22型光学显微镜观察并记录病原菌的孢子萌发率和芽管伸长长度（以芽管伸长长度大于或等于孢子直径时记为孢子萌发）。每组处理重复3 次，每次重复观察100 个孢子。

1.3.2.3 几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶活力的测定

几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶活力测定参照Abeles等[21]的方法进行测定。称取2 g果实冻样，用5 mL 0.1 mol/L pH 5.2的乙酸-乙酸钠缓冲液（含1 g/L抗坏血酸和5 mmol/L β-巯基乙醇）冰浴研磨匀浆来提取粗酶液。几丁质酶活力通过测定水解产生N-乙酰葡萄糖胺的量来反映，以每分钟反应液在524 nm波长处吸光度增加0.001为一个几丁质酶活力单位（U）。β-1,3-葡聚糖酶活力根据生成还原糖的量测定，以每小时生成1 mg葡萄糖为1 个β-1,3-葡聚糖酶活力单位（U）。单位为U/g，结果以湿质量计。

1.3.2.4 PAL活力、总酚含量的测定

PAL活力的测定参照Assis等[22]方法稍作修改，反应体系由50 mmol/L pH 8.8硼酸缓冲液（2.5 mL）、40 mmol/L L-苯丙氨酸（0.5 mL）和上清液（1 mL，由提取到的粗酶液离心后得到）组成，在37 ℃条件下水浴反应80 min，以每小时290 nm波长处吸光度变化0.01为一个PAL活力单位（U），单位为U/g。总酚含量根据Folin-Ciocalteu法[23]测定，用体积分数80%丙酮（含体积分数0.2%甲酸）提取粗酶液，单位为mg/100 g。结果均以湿质量计。

1.3.2.5 活性氧代谢相关酶活力及H2O2生成量的测定

SOD活力测定参照Rao等[24]的方法，以抑制50%的NBT光还原反应为一个酶活力单位（U）。CAT和抗坏血酸过氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）活力分别参照Cakmak[25]和Nakano[26]等的方法稍作修改，于30 ℃下水浴10 min，以反应液每分钟在240 nm和290 nm波长处吸光度降低0.01为一个酶活力单位（U），单位均为U/g。H2O2含量参照Patterson等[27]的方法测定，称取2 g冻样用5 mL 100%冷丙酮仔细研磨提取上清液，单位为μmol/g。结果均以湿质量计。

1.3.2.6 抗病相关基因表达丰度的测定

葡萄果实总RNA用经过修改的CTAB法[28]提取，取8 g左右葡萄果肉经液氮充分研磨后加入到含10 mL CTAB（含体积分数2% β-巯基乙醇，现用现配）提取液的离心管中，漩涡振荡后置于65 ℃水浴中裂解40 min，12 000 r/min、4 ℃离心20 min取上清液，用等体积氯仿抽提2 次后加入1/4体积的10 mol/L LiCl3，4 ℃下沉淀过夜。13 000 r/min、4 ℃离心30 min后弃上清液，沉淀经500 μL SSTE混合液（含1.0 mol/L NaCl、0.5 g/100 mL十二烷基硫酸钠、10 mmol/L pH 8.0 Tris-HCl和1 mmol/L乙二胺四乙酸，50 ℃预热）洗脱后用氯仿再次洗脱2 次。得到的上清液加入两倍体积无水乙醇，混匀后置于－20 ℃沉淀3 h，再次离心弃上清液，保证乙醇充分挥发，用DEPC处理水溶解后得到葡萄果实总RNA。用NanoDrop 2000分光光度计测定RNA质量浓度，并通过凝胶电泳检测RNA质量，随后用RNase-free水标定RNA质量浓度约为200 ng/μL，经Prime ScriptTMRT Master Mix试剂盒反转录为cDNA，－80 ℃保存备用。

选择葡萄果实的VvCHI、VvGNS和VvPAL-like3 个抗病相关基因进行qPCR测定，其特异性引物根据NCBI设计得到（表1）。不同基因的表达水平用SYBR®Premix ExTaq™试剂盒进行测定，所用cDNA经过5 倍体积稀释后取2 μL加入到20 μL反应体系中。将Quant Studio™Real-Time PCR仪器程序设置为：初始反应95 ℃、30 s，而后经过95 ℃ 5 s、60 ℃ 34 s的40 个循环，最后通过95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min、95 ℃ 15 s终止反应。通过稀释法分析最终扩增产物的熔解曲线来评价引物的特异性。将反应结果用阈值周期（Ct值）进行归一化处理，用2-ΔΔCt法[29]来表示目标基因相对于管家基因（VvActin）的相对表达水平。

表1 葡萄果实抗病相关基因特异性引物序列Table 1 Sequences of specific primers used for amplification of the genes associated with disease resistance in grape berries

1.4 数据统计与分析

果实病斑直径重复测定10 次，其余指标均重复测定3 次。实验数据差异显著性采用SAS 8.2软件进行Duncan's多重比较分析，P＜0.05表示差异显著。用Origin 8.5软件作图。

2 结果与分析

2.1 EBR处理和B. cinerea接种对葡萄果实发病率与病斑直径的影响

如图1A所示，葡萄果实接种后发病率呈不断上升趋势，贮藏48 h内EBR+B. cinerea接种组的发病率显著低于B. cinerea接种组（P＜0.05），到贮藏终点60 h时两组间发病率无显著差异。如图1B所示，病原菌侵染葡萄果实表面后病斑直径不断扩展，整个贮藏期间EBR+B. cinerea接种组的病斑直径均显著低于B. cinerea接种组（P＜0.05）。在贮藏48 h和60 h时，EBR+B. cinerea接种组的病斑直径分别仅为5.26 mm和6.76 mm，分别为B. cinerea接种组的53.71%和56.98%。这些说明EBR处理可有效抑制葡萄果实接种B. cinerea后病害的扩展。

图1 EBR处理和B. cinerea接种对葡萄果实发病率（A）和病斑直径（B）的影响Fig. 1 Effect of EBR treatment on disease incidence (A) and lesion diameter (B) in grape berries inoculated with B. cinerea

2.2 EBR处理和B. cinerea接种对葡萄果实体外孢子萌发率和芽管伸长长度的影响

表2 EBR处理对B. cinerea孢子萌发和芽管伸长长度的影响Table 2 Effect of EBR treatment on spore germination and germ tube length of B. cinerea

如表2所示，B.cinerea经体外培养12、24、36 h后，5 μmol/L的EBR处理显著降低其孢子萌发率（P＜0.05），但对其芽管伸长长度无显著影响（P＞0.05）。说明EBR处理对B.cinerea孢子萌发有一定抑制作用，但不直接抑制其芽管生长。

2.3 EBR处理和B. cinerea接种对葡萄果实抗病相关酶活力的影响

图2 EBR处理和B. cinerea接种对葡萄果实几丁质酶（A）和β-1,3-葡聚糖酶（B）活力的影响Fig. 2 Effect of EBR treatment and B. cinerea inoculation on the activities of chitinase (A) and β-1,3-glucanase (B) in grape berries

如图2所示，贮藏前后对照组葡萄果实几丁质酶活力无明显上升趋势，而β-1,3-葡聚糖酶的活力呈不断上升趋势。单一EBR处理组果实的几丁质酶活力在贮藏48 h内显著高于对照组（P＜0.05），而其β-1,3-葡聚糖酶的活力在整个贮藏期间与对照组无显著差异（P＞0.05）。B. cinerea接种组和EBR+B. cinerea接种组果实在贮藏60 h内几丁质酶活力均呈不断上升的趋势，其中EBR+B. cinerea接种组果实几丁质酶在贮藏12 h时就被快速激活，且其活力一直显著高于其他3 组果实（P＜0.05）。B. cinerea接种组果实β-1,3-葡聚糖酶活力在贮藏48 h时达到峰值，而EBR+B. cinerea接种组果实则提前于36 h时达到峰值，且显著大于单一EBR处理组（P＜0.05），贮藏期间EBR+B. cinerea接种组果实两种酶活力在4 组中均为最高。这些结果说明EBR处理能够有效诱导葡萄果实接种B. cinerea后几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶活力的上升。

2.4 EBR处理和B. cinerea接种对葡萄果实PAL活力及总酚含量的影响

图3 EBR处理和B. cinerea 接种对葡萄果实PAL活力（A）和总酚含量（B）的影响Fig. 3 Effects of EBR treatment and B. cinerea inoculation on PAL activity (A) and total phenolic content (B) in grape berries

如图3所示，对照组果实的PAL活力和总酚含量在整个贮藏过程中均无明显变化。单一EBR处理在贮藏36 h后显著提高了总酚含量（P＜0.05），但在36 h之前对总酚含量无显著影响。经B. cinerea接种果实的PAL活力及总酚含量均在贮藏36 h达到峰值，分别为此时对照组的1.46、1.21 倍，随后快速下降。先经EBR处理后接种B. cinerea的葡萄果实PAL活力和总酚含量均在贮藏12～24 h时快速增加，在贮藏36 h时出现明显峰值，分别为对照组的2.08、1.36 倍，并在之后的贮藏过程中显著高于对照组果实（P＜0.05）。先经EBR处理后接种B. cinerea组的总酚含量只在贮藏的前36 h显著高于单一EBR处理组（P＜0.05），而36 h后两组差异不显著（P＞0.05）。

2.5 EBR处理和B. cinerea接种对葡萄果实活性氧代谢相关酶活力及H2O2生成量的影响

图4 EBR处理和B. cinerea 接种对葡萄果实SOD（A）、CAT（B）、APX（C）活力和E2O2含量（D）的影响Fig. 4 Effects of EBR treatment and B. cinerea inoculation on SOD (A),CAT (B) and APX (C) activity and H2O2 content (D) in grape berries

H2O2是植物细胞中最主要的活性氧自由基，而SOD、CAT和APX则是清除植物细胞中活性氧自由基的3 种关键酶。由图4A可知，先经EBR处理后接种B. cinerea诱导了葡萄果实SOD活力的升高，使得贮藏期间EBR+B. cinerea接种组果实SOD活力显著高于对照组和单一EBR处理组（P＜0.05）。

由图4B、C可知，在整个贮藏期间，葡萄果实CAT和APX的活力均呈先上升后下降的趋势，单一EBR处理显著抑制了后期CAT和APX活力的下降，而EBR+B. cinerea接种组果实CAT和APX活力在贮藏前期就快速增长，36 h时达到峰值后依然维持在较高水平直至贮藏结束。

由图4D可知，贮藏期间对照组和单一EBR处理组葡萄果实的H2O2含量变化趋势一致，整体呈缓慢上升趋势，单一EBR处理可以缓慢提高H2O2生成量；而经过EBR处理和未经过EBR处理的葡萄果实在接种B. cinerea后其H2O2含量立刻增加，并在贮藏36 h出现明显峰值，含量分别11.47 μmol/g和10.39 μmol/g，随后不断下降，这与CAT和APX活力变化一致。先经EBR处理后接种B. cinerea使得葡萄果实H2O2含量在贮藏24 h之后均显著高于单一B. cinerea接种组（P＜0.05），说明EBR处理诱导了H2O2的生成和积累。

2.6 EBR处理和B. cinerea接种对葡萄果实抗病相关基因表达丰度的影响

图5 EBR处理和B. cinerea接种对葡萄果实VvCHI（A）、VvGNS（B）和VvPAL-like（C）基因表达丰度的影响Fig. 5 Effects of EBR treatment and B. cinerea inoculation on gene expression levels of VvCHI (A), VvGNS (B) and VvPAL-like (C) in grape berries

如图5所示，与对照组相比，单独EBR处理不能显著诱导贮藏前期葡萄果实VvCHI、VvGNS和VvPAL-like基因的表达，只在贮藏48 h后这些基因的表达水平才显著高于对照组（P＜0.05）；B. cinerea接种处理可有效诱导VvCHI和VvPAL-like基因在贮藏24 h之后的表达，同时提高VvGNS基因在贮藏36 h之后的表达，其表达水平均显著高于单一EBR处理组；经EBR处理后再接种B. cinerea的果实中VvCHI、VvGNS和VvPAL-like基因表达丰度呈显著上升的趋势，在贮藏24 h之后均显著高于单一EBR处理的果实（P＜0.05），并始终保持高表达，在贮藏结束时分别为对照组水平的14.98、4.90、16.20 倍。

3 讨 论

BRs作为一种环境友好型化学激发子，在植物应对生物和非生物胁迫中发挥着重要作用[30]。本研究发现，5 μmol/L EBR处理能够显著抑制葡萄果实采后灰霉病的发病率和病斑直径的扩展，同时体外研究表明5 μmol/L EBR处理可显著抑制B. cinerea孢子的萌发，但对芽管伸长长度没有显著影响，这些结果说明EBR处理除了直接的抑菌作用外，很可能诱导提高了葡萄果实的抗病性，从而抑制果实灰霉病的发生。这与BABA处理对葡萄果实灰霉病影响的结果[31]相似。Zhu Zhu等[17]在枣果实上发现BRs对青霉菌没有体外抑菌效果，这可能是不同病原菌对BRs敏感性不同造成的。

当植物受到病原菌侵染后，会在感染部位诱导和积累大量PR蛋白使SAR，这就包括几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶[32]，两者共同作用于真菌细胞壁使其失去活力。PAL是苯丙烷代谢途径中的第一关键酶，与酚类物质和植保素合成密切相关，这两者的合成在抗病反应中起重要作用。本研究发现，经过和未经过EBR处理的接种组果实PAL活力与总酚含量变化趋势趋于一致，PAL活力升高的同时酚类物质大量生成，而酚类化合物具有直接抗真菌的能力，有利于形成一道抵抗病原菌侵入的屏障。说明EBR处理通过诱导PAL活力及总酚含量来增强果实抗病性，这与EBR在杏[15]中的研究结果一致。另外，单一EBR处理在贮藏前期不能显著诱导VvCHI、VvGNS和VvPAL-like基因表达，但随着贮藏后期发病率的升高，基因表达丰度明显上升。而EBR+B. cinerea接种处理则较单一EBR处理或B. cinerea接种处理更显著地诱导了抗病基因的表达，使得几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶和PAL活力在整个贮藏期间都维持在最高水平。这些结果表明EBR处理可诱导提高采后葡萄果实的抗病性，且只在病原菌侵染后才表现出更强、更快的抗病反应，说明EBR是通过Priming机制诱导葡萄果实的抗病性，从而有效抑制灰霉病的发生，这与BABA处理诱导草莓果实抗病性的结果[33]一致。

活性氧迸发是植物抵抗病原菌侵染的重要防卫反应，其中H2O2可以作为信号分子诱导系统的抗性，同时激活抗氧化相关酶活力和PR基因表达，而H2O2含量受到SOD、APX、CAT等活性氧代谢酶调控，其中CAT和APX可以协同清除H2O2。已有研究证实H2O2作为信号分子在EBR诱导抗性中发挥着重要作用，其持续的高含量提高了生物体抵抗病原菌入侵的应激防御能力[34-35]。本研究发现，不经接种的EBR处理可以缓慢提升整个贮藏期间H2O2含量，而当接种B. cinerea后，H2O2含量立刻迸发，并在36 h达到高峰，并且EBR+B. cinerea接种组果实H2O2含量在整个贮藏期间都保持最高水平。这揭示了EBR通过诱导H2O2积累来提高葡萄果实抗病性。另外，实验结果显示EBR处理提高了SOD、APX和CAT活力，且在面对病原菌侵入时显著增加，与Cao Shifeng等[36]的研究结果一致。说明贮藏前期高浓度H2O2诱导活性氧代谢酶活力升高以清除过量活性氧，而贮藏后期H2O2含量呈下降趋势，但依然保持高水平，延缓了活性氧代谢酶活力的下降，从而保持细胞稳态，这与在柑橘[18]中的研究结果一致。因此，推测H2O2可以作为信号转导分子对EBR诱导葡萄果实抗病性起关键作用。

综合以上研究结果表明，经5 μmol/L EBR处理的葡萄果实不立刻展现强烈的抗病性，只有受到病原菌胁迫时才会展现出更为强烈的抗病反应，包括活性氧迸发、总酚含量和抗病相关酶活力升高及PR基因表达水平增加等，这符合Priming机制的典型特征。因此推测EBR处理主要是通过Priming机制诱导提高葡萄果实的抗病性，从而抑制灰霉病的发生。