谷物酚酸合成途径及代谢调控研究进展

马 燕，魏 媛，王 冕，孙毛毛，王 沛，顾振新，杨润强*

（南京农业大学食品科技学院，江苏 南京 210095）

酚酸是一类具有酚羟基结构的化合物，几乎存在于所有的植物源食物中。酚酸对植物的生长发育有重要影响，在养分吸收、光合作用、蛋白合成及细胞骨架与结构建成等方面均有一定作用[1]。酚酸也能提高植物的抗逆性，能在植物面对病虫害等生物胁迫及低温、干旱、紫外辐射和盐胁迫等非生物胁迫下大量累积。不仅如此，酚酸大多都具有药理活性，对人体具有较强的抗氧化[2]、抗癌[3]、抑菌[4]、抗感染[5]、降血糖及胆固醇[6]等重要作用。因此植物体内的酚酸类化合物已受到广大学者重视，相关研究也于近些年展开。

酚酸在人体中不能自行合成，需要从食物中获取，以往的研究普遍认为蔬菜和水果较谷物具有更高的酚酸含量及生物活性，随着谷物中大量结合酚酸的发现，人们才逐渐认识到谷物也是膳食多酚的重要来源之一，其多酚含量与果蔬相当。谷物中甚至还有一些特殊的高活性酚类物质，如燕麦中的蒽酰胺、高粱中的3-脱氧花青素等[7]。研究谷物中的酚酸，不仅能更清晰地了解其组成及分布，并且对于深入挖掘其营养价值及开发功能性产品具有长远意义。基于此，本文对谷物中酚酸的种类及分布、生物合成途径与代谢调控等方面进行综述。

1 谷物中的酚酸类物质

1.1 谷物中酚酸的存在形式

天然酚酸一般由两个不同的碳架组成：羟基肉桂酸和羟基苯甲酸结构。虽然基本骨架保持不变，但芳香环上羟基的数量和位置变化却能产生1 000多种酚酸类化合物。羟化肉桂酸衍生物主要有对香豆酸、阿魏酸、芥子酸和咖啡酸，结构上具有C6-C3特点，它们通常与奎尼酸或葡萄糖酯化形成化合物；羟化苯甲酸衍生物主要有对羟基苯甲酸、没食子酸、香草酸、丁香酸和原儿茶酸，具有C6-C1结构，它们除被酯、配糖取代外[8]，多以游离形式存在，或者与糖类及有机酸以共价结合形成酚酸衍生物，或者与细胞壁连接形成木质素[9]。

表1 谷物中游离态酚酸与结合态酚酸的含量及占总酚酸比例Table 1 Contents and percentages of free and bound phenolic acids in cereals

谷物籽粒中的酚酸只有少部分以游离态存在，多数与纤维素（玉米[10]）、蛋白质（玉米[10]、小麦[11]）、木聚糖（小麦、玉米、大麦等[12]）、阿拉伯木聚糖（玉米[10]）和半纤维素（麸皮[11]）等结合存在于植物的细胞壁中[13-14]。不同谷物中的游离态及结合态酚酸含量不同（表1），大部分谷物中酚酸主要以结合形式存在，其中阿魏酸是主要的酚酸，游离态、可溶性结合态、结合态的阿魏酸质量之比为0.1∶1∶100[15]。大多数谷物中结合态酚酸占总酚酸含量的70%～90%[16]。但是由于谷物存在产地、品种间差异以及酚酸提取方法存在差异，因此可以发现同种谷物中酚酸含量及占总酚酸比例存在较大差别，如Das等[17]研究结果表明玉米中游离态酚酸占总酚酸含量的5.8%～8.6%，而del Pozo-Insfran等[18]的研究结果中却高达44.8%（white corn），甚至70.9%（blue corn），超过结合酚酸含量，这主要与谷物品种有关。

1.2 谷物中酚酸的组成

不同品种谷物间酚酸种类及含量差别较大[7]。研究发现，玉米中主要酚酸为阿魏酸（4 543.2 μg/g（以干质量计，下同））、香草酸（2 123.2 μg/g）、丁香酸（1 236.3 μg/g）和原儿茶酸（443.9 μg/g）[17]。糙米中主要的酚酸为阿魏酸（1 262.3 μg/g）和香豆酸（390.1 μg/g），其次为丁香酸（56.7 μg/g）和咖啡酸（43.7 μg/g）等[19]。小麦中的主要酚酸为阿魏酸（199.5 μg/g）、对羟基苯甲酸（97.1 μg/g）和对香豆酸（4.7 μg/g）[22]。大麦和燕麦中的主要酚酸都是阿魏酸、对香豆酸和芥子酸[23]，其中大麦的这3 种酚酸含量依次为323.8、76.1、41.9 μg/g，燕麦则分别为1 044.9、607.2、107.1 μg/g。

同种类不同品种的谷物间酚酸组成及含量亦有较大差异。Das等[17]对印度产的凹玉米和硬质型黄玉米酚酸含量进行分析，发现阿魏酸、香草酸、丁香酸和原儿茶酸4 种主要酚酸的变异幅度分别为3 455.4～4 543.2、1 792.1～2 123.2、722.0～1 232.3 μg/g以及449.9～756.4 μg/g，而结合态的对羟基苯甲酸只存在于硬质型黄玉米中，且含量高达299.0 μg/g。Okarter等[21]在对不同类型大麦品种籽粒中酚酸含量进行分析时发现存在同样现象，6 种小麦中阿魏酸、对香豆酸、丁香酸、香草酸、咖啡酸平均含量变幅为624.9～963.4、67.5～76.3、20.8～30.7、7.2～12.8、13.5～20.9 μg/g，其中软质红小麦没有结合态的丁香酸。

1.3 谷物中酚酸的分布部位

谷物一般由糠麸（种皮、果皮和糊粉层）、胚芽和胚乳3 部分组成，其中富含淀粉的胚乳约占整粒谷物质量的75%～80%，糠麸和胚芽则占质量比较少，然而谷物中酚酸却多集中在其糠麸和胚芽部位，胚乳部位含量较少[30-31]。例如，黑米中麸糠部位酚类物质的含量是淀粉胚乳部位的38～41 倍[30]，小麦麸糠部位酚类物质的含量是淀粉胚乳部位的15～18 倍[31]。在全麦面粉中，83%的酚类来源于糠麸，小麦中总酚含量由高到低为：麸糠部位＞粗制面粉过筛后筛余部分＞粗制面粉（饲料级）＞全面粉（食品级）＞精制面粉[9]。Baublis等[32]也发现小麦中所含酚酸等主要存在于麸皮和糊粉层，以结合形式存在。Zhou Zhongkai等对稻米中的酚酸分布进行了研究，发现在未去壳的糙米中，阿魏酸含量达到255～362 μg/g，香豆酸含量为70～152 μg/g，均远大于去壳之后的精制米[33]。

2 酚酸合成途径关键酶基因

图1 植物中酚酸的生物合成途径[34-35]Fig. 1 Biosynthesis pathway of phenolic acids in plants[34-35]

植物酚类化合物的生物合成途径已基本探明（图1），其前体物质一般来源于糖酵解和磷酸戊糖途径的中间产物，经过莽草酸途径和苯丙烷类代谢途径合成酚酸、黄酮及木质素等各种酚类物质[34]。莽草酸途径是指莽草酸通过分支酸、预苯酸经转氨作用形成苯丙氨酸，从而进入苯丙烷代谢途径。苯丙烷类代谢途径是酚酸生物合成的主要途径，即L-苯丙氨酸经苯丙氨酸解氨酶（phenylalanineam-monia-lyase，PAL）脱去苯丙氨酸的氨基，转化为反式肉桂酸，在肉桂酸-4-羟化酶（cinnamate 4-hydroxylase，C4H）的作用下，形成反式肉桂酸、对香豆酸、芥子酸和阿魏酸等酚酸。这些酚酸在4-香豆酸辅酶A连接酶（4-coumarate CoA-ligase，4CL）、甲基转移酶（O-methyltransferase，OMT）等酶的催化作用下，可进一步转化为香豆素、咖啡酸和绿原酸等，也可形成CoA酯，再进一步转化为木质素和类黄酮等[35]。此外，在少数植物中还发现其他代谢途径，主要生成羟基苯甲酸类酚酸：没食子酸可经莽草酸脱水作用后直接形成；水杨酸可通过分支酸在异分支酸和酶以及丙酮酸裂解酶的催化作用下合成；对羟基肉桂酸类酚酸、类黄酮等也可直接降解生成对羟基苯甲酸类酚酸[36]。

2.1 PAL基因

PAL在植物次生代谢过程中有重要作用，于1961年首次在大麦中发现并得到纯化[37]。目前已对水稻[38]、金荞麦[39]、甜荞[40]、大麦[41]和小麦[42]等多种谷物进行了PAL基因的cDNA克隆和序列分析。研究发现，PAL由多基因家族编码，编码PAL的基因数量在不同谷物中有所不同，例如在大麦中发现有11 个PAL基因[41]，小麦中则只有4 个PAL基因[42]，并且发现PAL基因在植物组织中的表达具有特异性。例如，在菜豆的根中3 个PAL基因（PAL1、PAL2和PAL3）均能大量表达，叶中只有PAL1表达；花瓣中则是PAL2大量表达，PAL1表达量很少，PAL3不表达。迄今为止，PAL已得到广泛深入的研究，证实该酶参与花青素积累、木质化、黄酮类物质合成以及病虫害防御等多种生理过程[43-44]。虞光辉等[42]发现接种禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）后小麦PAL基因表达上调且对小麦抵抗赤霉病菌起到一定作用。PAL是苯丙烷类代谢途径的关键酶与限速酶，其活性对酚类物质的形成速率有重要影响。

2.2 C4H基因

C4H于1967年首次从豌豆中克隆得到，是目前在植物中研究最多的P450单加氧酶，编码该酶的基因C4H是植物中第一个被克隆出来的细胞色素基因，也是第一个确定功能的植物细胞色素基因，它在植物各组织中都具有很高的活性[45]。目前已在小麦、苦荞、高粱和大麦[46]等多种谷物中克隆出C4H基因，编码C4H的基因数量在不同植物中有所不同，现已发现苜蓿有2 个C4H基因，棉花中也有2 个C4H基因，而豌豆等则多为1 个C4H基因。C4H基因在植物中的表达具有特异性，有研究表明，C4H基因在毛竹的不同发育时期和不同组织中表达不同，在冬笋中表达量最高，在春笋基部表达量最低[47]。C4H在植物木质素合成中具有重要作用，将高粱木质素合成抑制突变体sbC4H基因转入到拟南芥中，明显地抑制了拟南芥木质素的合成[48]；抑制烟草C4H基因的表达能显著抑制其木质素的合成，并且C4H活力比PAL低很多，这意味着C4H可能是苯丙烷代谢途径中较PAL更关键的限速酶[49]。另外，C4H也对酚类物质的合成有重要作用，Millar等[50]研究发现C4H蛋白的活性和转录丰度能直接影响番茄中黄酮类化合物和绿原酸的合成量，Ma Yan等[51]研究发现C4H活性能直接影响大麦中酚酸的合成量。

2.3 4CL基因

4CL于1976年由Mansell等首次从嫩柳枝中提取出来[52]。4CL是一个小的多基因家族，但其基因序列和所编码的蛋白同源性很高，且蛋白亚基分子质量都比较接近。目前已在水稻、玉米、大麦等谷物中克隆出4CL基因，编码4CL的基因可分为两组，就水稻而言，组I中Os4CL2主要参与调控黄酮类化合物的生物合成，而组II中的Os4CL1、Os4CL3、Os4CL4和Os4CL5则主要负责木质素的生物合成[53]。4CL基因在植物中的表达具有组织特异性，在对青稞不同发育时期4CL基因表达分析发现，其在不同组织中的表达丰度不同，茎中表达量最高，其次是叶和籽粒，并且在植物不同组织器官的表达模式也不同[54]。4CL处在苯丙烷类代谢中合成特定产物的转折点上，其可生成绿原酸、羟基肉桂酸等酚酸类物质，也可以作为重要的前体物质介入类黄酮代谢[34]。

2.4 C3H基因

C3H是一种细胞色素P450单加氧酶，是咖啡酸和木质素生物合成途径中的关键酶和限速酶。C3H的研究进展较慢，直到2001年Schoch等[55]对拟南芥基因组中细胞色素P450基因通过系统发育和结构分析分离出了CYP98A3基因，并首次用功能基因组的方法证明了该基因是C3H基因。随后Franke等[56]用定位克隆方法分离了拟南芥REF8基因，并通过原核表达证明其编码C3H。Abdulrazzak等[57]于2006年将一个T-DNA插入到拟南芥的CYP98A3基因，此突变致使植株生长发育受阻，茎中木质素的组成和拟南芥REF突变体相似，进一步证明了Franke等[56]的实验结果，也初步证实CYP98A3为编码C3H的基因，目前该基因已在荞麦以及小麦等谷物中克隆。在杂交杨中抑制C3H活性后，木质素含量降低，淀粉含量增加，促进了黄酮类化合物的合成，导致叶片花青素积累[58]。

2.5 COMT基因

COMT主要参与次生代谢途径中一些小分子的甲基化，如生物碱生物合成、木质素的合成、类黄酮生物合成等。Guillet-Claude等[59]克隆了33 种不同杂交品种玉米的COMT基因，获得了部分或全长cDNA。其他谷物如水稻、高粱、小麦[60]等的COMT基因也已成功克隆与表达。COMT在不同植物中的作用不同，在单子叶和双子叶被子植物中能够分别催化咖啡酸和5-羟基阿魏酸生成阿魏酸和芥子酸[61-62]，然而在裸子植物中COMT只能催化阿魏酸而不能催化5-羟基阿魏酸的转化[62]。

2.6 F5H基因

F5H是合成S型木质素的关键酶，是木质素合成中的第3个细胞色素P450单氧化酶。F5H在木质素合成途径中的底物确认经历了漫长的争论，以往研究认为F5H羟基化主要发生在羟基肉桂酸水平上，后来发现F5H不仅可以催化阿魏酸C5位的羟基化反应生成5-羟基阿魏酸，并且能够催化松柏醛和松柏醇使之发生羟基化，并且对后者的亲和力远高于对阿魏酸的亲和力[63]。目前F5H基因已从小麦[60]和水稻[64]等谷物中分离克隆。

3 谷物中酚酸代谢调控

3.1 发育信号

大量研究表明，PAL基因表达严格受发育信号的调控。在植株生长过程中，当组织内部有发育信号暗示需要增加苯丙烷类代谢物时，PAL基因的表达量就会在特定组织部位被上调[65]。酚酸合成酶系的活性在植物生长发育过程中不断地变化，例如在小麦、玉米、水稻、大麦、燕麦以及荞麦等谷物的种子萌发及幼苗生长过程中PAL、C4H和4CL活性均动态变化，一定时间内随着发芽的进行酶活力逐渐升高，于是谷物中自由态和结合态的酚酸类物质被释放出来[66]。Subba等[29]对小米发芽过程中酚酸含量及状态进行了研究，发现种子萌发后，原儿茶酸和咖啡酸含量下降，而没食子酸、香草酸、香豆酸、阿魏酸含量增加，且酚酸从结合态向游离态转变。

3.2 环境因素

谷物中酚酸代谢的酶基因除受自身发育信号调控外，也极易受到外界各种刺激因子的诱导，如光照信号、环境温度、水分、盐胁迫以及机械伤害、病原微生物感染、昆虫取食等生物和非生物环境均能诱导相关基因在转录水平上快速表达。

研究发现光照有利于苦荞芽中绿原酸、对香豆酸和阿魏酸含量的提高，增强了苦荞芽的抗氧化能力[67]。不同光源对植物中酚酸含量亦有影响，Liu Hongkai等[68]研究发现蓝色发光二极管灯处理显著增加了豌豆芽中绿原酸、没食子酸、咖啡酸、对香豆酸和阿魏酸的含量；持续紫外线（ultraviolet，UV）-B辐照会对植物的光合作用、蒸腾作用和授粉等产生影响并引起细胞损伤。为了避免伤害，植物会合成黄酮（如花青素）及酚酸（如咖啡酸、对香豆酸和阿魏酸）以吸收UV-B，保护组织。UV-B辐射2 min和3 min导致柠檬外表皮中紫外吸收物质和总酚酸含量显著增加。最常见的植物胁迫源是温度（低或高）和水分（旱或涝），研究表明，低温和热胁迫通过刺激酚类物质合成途径的限速酶PAL进而促进植物中酚类物质的形成[69-70]。研究发现，干旱胁迫下小麦通过酚酸类物质积累来抵御氧化胁迫，且结合态酚酸较游离酚酸更加有效地发挥了保护作用[71]。另外，研究发现质量分数3%的NaCl溶液胁迫能显著增加糯米中原儿茶酸、对香豆酸和阿魏酸的含量[72]。

3.3 植物激素

植物内源激素在调控植物生长发育和代谢活动中起着非常重要的作用，可利用其对酚类成分合成的促进作用，提高植物的抗氧化及其他各种生物活性。常用的植物激素包括脱落酸、赤霉素、茉莉酸（jasmonic acid，JA）和茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）、乙烯、水杨酸等。

3.3.1 脱落酸

研究表明，脱落酸增强了PAL活性，降低了PPO活性，进而可以间接地促进酚类物质的合成，减缓酚类物质的氧化作用[73]。在种子萌发过程中，PAL活性逐渐升高，脱落酸处理对PAL活性有促进作用，田晓艳等[74]研究结果表明，在不同时期施用脱落酸都能显著提高南果梨果皮花青素含量，作用机理可能是外源脱落酸可以通过降低类胡萝卜素、叶绿素含量，增加PAL、CHI活性，从而增加花青素含量。研究表明脱落酸对低温胁迫下玉米幼苗根系的生长有调节作用，而这一调节作用是通过增加PAL和PPO活性，进而显著增加玉米幼苗的总酚和总黄酮含量实现的[75]。

3.3.2 赤霉素

赤霉素在植物体内以结合态和游离态两种状态存在，在种子的萌发过程中，经过酶促水解作用，结合态的赤霉素转变为游离态发挥生理作用，对植物的生长发育及植物抗逆性作用的发挥有着重要作用。赤霉素对植物花青素含量的影响研究较多，赤霉素可以影响糖诱导下植物体内花青素的积累，胡朝阳等[76]以紫薯为研究对象，研究结果显示，赤霉素对查耳酮合酶（chalcone synthase，CHS）的表达具有促进作用，进而导致花青素的大量积累；蔗糖不能显著影响CHS的表达，但对花青素的积累具有促进作用。在赤霉素的作用途径中，负调节物质DELLA蛋白发挥主要作用，通过活性赤霉素的激活使得自身被蛋白酶水解，消除抑制作用使植物正常生长，这种蛋白也被发现在拟南芥花青素合成中发挥作用，它可以作用于F3H等花青素合成基因，王可可[77]在研究赤霉素对心里美萝卜花青素代谢中的作用过程中发现，DELLA蛋白基因RGA1对花青素合成相关基因的影响一致性主要体现在花青素还原酶上。

3.3.3 JA和MeJA

MeJA作为JA的衍生物，具有较强挥发性且不易被离子化，可有效透过植物细胞膜发挥信号分子作用，能够诱导植物防御基因表达和多种次生代谢产物的合成调节。研究表明，MeJA可对多种植物细胞生长发育及采摘后贮藏过程中的多酚类成分产生影响，受到影响的酚酸成分主要有没食子酸、原儿茶酸、丁香酸和绿原酸等，其机制是调控苯丙氨酸途径关键酶基因的表达及诱导相关酶活性的上升[78]。在萝卜幼苗生长过程中，MeJA处理后多种基因（RsPAL、RsC4H、Rs4CL、RsCHS、RsCHI、RsF3H、RsDFR、RsANS、RsMYB）的表达上调，进而提高酚类物质的合成[79]。

3.3.4 乙烯

乙烯对次生代谢产物的调控是细胞内外多种因素综合作用的结果，各因素均存在交叉反应和相互作用，在细胞内形成复杂的反馈调节机制，最终形成乙烯对次生代谢产物的双重调控效应。研究表明喷洒乙烯利能够明显刺激苦荞发芽过程中次级代谢产物黄酮的生成和提高PAL活性[80]。乙烯处理绿豆芽后打破了绿豆芽体内的氧化还原平衡，使得绿豆芽的非酶促氧化系统中PAL活性增强，促进了酚类物质的合成，且总酚含量随着乙烯浓度的升高而增大[81]。

3.3.5 水杨酸

水杨酸为一种外源信号分子，能促进植物生长，调节种子发芽，调控乙烯合成，诱导植物抗病、抗旱、抗盐等防御反应，通过多种途径调节植物的各种合成代谢过程，从而提高代谢产物。研究表明，一定浓度的水杨酸处理可以提高小麦幼苗中酚类化合物的积累[82]。利用葡萄浆果的体外培养技术研究水杨酸对PAL的诱导机制，结果表明，水杨酸可以诱导PAL mRNA的积累和PAL蛋白的合成，提高PAL活性。另外，水杨酸诱导PAL活化可以通过添加蛋白质合成抑制剂、mRNA转录抑制剂或PAL抑制剂对浆果组织进行预处理来阻断，这表明水杨酸介导的获得性系统抗性激活可能是通过诱导PAL基因的表达引起的[83]。

3.4 其他调控

稀土元素作为一类具有生理活性的元素，对植物的代谢、产量和品质的影响有着重要作用。有研究表明，稀土元素作为一种外源添加物，可以促进植物次生代谢产物的合成，Liang Bin等[84]研究表明一定剂量的镧可以提高大豆幼苗的黄酮含量和PAL活性。此外，适当增加施氮量会提高小麦籽中阿魏酸、对香豆酸和香草酸的含量[85]。

4 结 语

谷物酚酸是膳食多酚的重要来源之一，占日膳食摄入量1/3以上。尽管目前已对谷物酚酸重视起来，对其生物合成途径、代谢与调控及其生物活性有了一定的认识，已成功地克隆了部分酚酸合成途径中关键酶的基因，并研究了相关基因的功能，但是相对于其他植物来说研究还是相对滞后，进而限制了谷物酚酸的开发和利用。未来的研究一方面可从种植栽培、品种资源等方面开展，研究培育高酚酸的种质资源；另一方面也要重视现有谷物在食品工业上的独特价值，对谷物的精深加工和功能因子开发等展开研究。由于酚酸多数以结合形式存在于谷物的糠麸层，因而对于传统废弃或直接当饲料的谷物加工副产物应当综合开发利用。随着经济的发展和生活水平的不断提高，人们更加注重营养和健康，鉴于酚酸对人体健康的重要性，谷物酚酸在人体内吸收和代谢的方式也有待深入研究。高效、科学地利用我国丰富的谷物酚酸这一重要资源不仅关系到谷物本身的产品增值，进而推动种植业的发展和谷物种植地区的经济发展，更关系到国民健康，因而深入研究谷物中的酚酸具有重要意义。