四纹豆象Toll与抗菌肽基因对种群密度的响应

陈千权，王野影

(贵州师范大学 生命科学学院，贵州 贵安 550025)

高种群密度环境易导致寄生和疾病发生，因此，随着种群密度增加，个体感染疾病的概率也相应增加。在长期进化和自然选择过程中，个体发展出能感知种群密度并能根据种群密度调整免疫反应的能力[1]。与病原体感染相似，高种群密度可提升昆虫的预防性免疫能力。昆虫免疫系统包括体液免疫和细胞免疫，前者主要包括抗菌肽和酶联反应，后者主要包括血细胞防御反应，如吞噬作用和封闭作用[2-3]。由于缺乏后天免疫系统，昆虫能识别非自身抗原并能迅速放大感染信号。感染信号主要通过Toll和IMD(Immune deficiency)通路进行转导，进而激活脂肪体中表达抗菌肽并释放到血淋巴中。先天免疫系统是昆虫对抗细菌、真菌和病毒等病原体入侵的重要防线。革兰氏阳性菌和真菌可激活Toll信号通路而激活抗菌肽表达，而革兰氏阴性菌主要通过激活IMD信号通路而激活抗菌肽表达[4]。果蝇中Toll-1和Toll-9过表达可诱导抗菌肽表达[5]，Toll-5和Toll-9能激活抗真菌肽(Drosomycin)的表达[6]。病毒可通过Toll-7而激活抗病毒自噬反应[6]，通过自噬抑制病毒复制[7],而Toll-8负调控呼吸道上皮抗微生物反应[8]。Toll信号通路除参与免疫信号转导外也调控发育过程。Toll-2参与卵泡细胞及唾液腺发育[9]，Toll-7和Toll-10调控胚胎发育过程中前后轴延伸[10]，Toll-8参与胚胎时期中枢神经系统和腿发育[9]。与此相似，家蚕Toll-1和Toll-2在卵巢中高表达，二者可能在胚胎发育中具有重要作用[11]。Toll信号通路相关基因对昆虫生存至关重要，因此，其相关基因可作为有害昆虫管理的靶基因[12]。

四纹豆象是全球分布的重要仓储害虫，依赖种群密度展现明显的表型可塑性，即在高种群密度条件下，个体行为更活跃、个体发育更快速、性成熟更早、产卵更早、产卵数量更少[13]。四纹豆象免疫信号转导相关基因尚未鉴定，相关基因的表达量与种群密度的关系仍不清楚。鉴于此，本研究尝试从四纹豆象转录组数据中鉴定免疫信号转导及抗菌肽相关基因，并阐明这些基因表达量与种群密度的关系。

1 材料和方法

1.1 昆虫饲养

野生四纹豆象经形态和细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ测序鉴定后，于2016年7月将其引入并饲养。组织培养瓶(0.2 L)盖上开5 cm × 5 cm孔，用纱布封住，既保证透气又防止四纹豆象逃逸。在盛有100粒黑绿豆的瓶中置入2对豆象，以建立低密度试验种群。在盛有相同数量黑绿豆的瓶中置入15对豆象，以建立高密度试验种群。饲养5代后开始试验，每个密度设立3个生物重复。饲养条件：温度为(30±2)℃，光周期L∶D为16∶8，相对湿度为50%～70%。

1.2 Toll、IMD与抗菌肽基因的鉴定

从FlyBase中下载黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)Toll与IMD相关蛋白质序列：Toll-1(CG5490)、Toll-2(CG8896)、Toll-3(CG1149)、Toll-4(CG18241)、Toll-5(CG7121)、Toll-6(CG7250)、Toll-7(CG8595)、Toll-8(CG6890)、Toll-9(CG5528)、IMD(CG5576)、肽聚糖识别蛋白LC[PGRP-LC(CG4432)]。从NCBI中下载赤拟谷盗(Triboliumcastaneum)Toll、IMD相关蛋白质序列：Toll-1(Tc000176，NCBI：LOC655507)、Toll-2(Tc004452，NCBI：LOC662755)、Toll-3(Tc004438，NCBI：LOC656158)、Toll-4(Tc004439，NCBI：LOC656071)、Toll-6(Tc004895，NCBI：LOC660697)、Toll-7(Tc004474，NCBI：LOC661135)、Toll-8(Tc004898，NCBI：LOC660808)、Toll-9(Tc033974，NCBI：LOC662131)、Toll-10(Tc004901，NCBI：LOC661030)、IMD(XP_008199405.1)、PGRP-LC(XP_008192547.1)。

从FlyBase中下载黑腹果蝇抗菌肽蛋白序列：Drosomycin(CG10810)、Defensin(CG1385)、Cecropin A1(CG1365)、Cecropin A2(CG1367)、Drosocin(CG10816)、Metchnikowin(CG8175)。从NCBI中下载鞘翅目昆虫抗菌肽蛋白序列：黄粉虫(Tenebriomolitor)Tenecin-1(BAA04552.1)，东北大黑鳃金龟(Holotrichiadiomphalia)Holotricin-1(2107186A)，三开蜣螂(Copristripartitus)Coprisin(ABP97087.1)，ZophobatratusDefensin B(AAB20745.1)、Defensin C(AAB20746.1)，古铜异丽金龟(Anomalacuprea)Defensin A(BAD77966.1)、Defensin B(BAD77967.1)，犀角金龟(Oryctesrhinoceros)Defensin(BAA36401.1)，独角仙(Allomyrinadichotoma)Defensin(AAB36306.1)，AcaloleptaluxuriosaDefensin 1(AAK35160.1),Cecropin(BAD66670.1)。鉴于缺乏鞘翅目昆虫富含脯氨酸抗菌肽信息，而鞘翅目与膜翅目亲缘关系相对较近，下载相关膜翅目抗菌肽蛋白序列：意大利蜜蜂(Apismellifera)Apidaecin-1(P35581.1)、Apidaecin-2(Q06601.1)、Abaecin(NP_001011617.1)，红牛头犬蚁(Myrmeciagulosa)Formaecin(P81437.1)，BombuspascuorumApidaecin(P81464.1)、Abaecin(P81463.1)，PteromaluspuparumAbaecin-like(ABS44869.1)。

从NCBI下载四纹豆象腹部转录组序列[14]。在Bioedit中通过本地tBLASTn比对鉴定相关基因，将核苷酸序列翻译成氨基酸序列(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)后，在Molecular Evolutionary Genetic Analysis software version 6(MEGA 6)中经多重比对(ClustalW)后构建最大似然(Maximum likelihood)进化树，重复次数为1 000次。蛋白质序列之间的一致性(Identities)、相似性(Positives)和间隙(Gaps)通过Bioedit软件计算。蛋白质结构域采用SMART程序(https://smart.embl.de/)预测。

1.3 表达量分析

四纹豆象腹部组织经液氮速冻并转移至-80 ℃保存，部分组织样品送北京百迈客生物科技有限公司进行高通量测序，以特定基因片段数量除以其长度后对上述所有序列数量的比值(Fragments per kilobase of exon per million reads mapped，FPKM)衡量基因表达量。以t检验判定相应基因在高密度群体和低密度群体中的表达水平是否存在显著差异。

2 结果与分析

2.1 四纹豆象Toll与IMD相关基因的鉴定

面对革兰氏阳性菌和真菌时，昆虫通过Toll信号通路提升预防性免疫，而面对革兰氏阴性菌时，昆虫通过IMD信号通路提升预防性免疫。与病原体感染相似，高种群密度可提升昆虫的预防性免疫。为揭示种群密度调控四纹豆象免疫反应的信号通路，从四纹豆象腹部转录组数据中鉴定到Toll信号通路的关键受体基因Toll-1、Toll-3、Toll-6、Toll-7、Toll-8、Toll-10；IMD信号通路的胞内关键信号分子基因IMD和受体基因PGRP-LC(肽聚糖识别蛋白LC基因)(表1)。

表1 四纹豆象Toll与IMD基因序列号Tab.1 Sequence numbers of Toll and IMD genes in Callosobruchus maculatus

通过转录组所得Toll相关基因的部分序列，Toll-1、Toll-8、Toll-10序列较短而Toll-3、Toll-6、Toll-7序列较长(图1A)。将四纹豆象Toll基因序列翻译为蛋白质序列后进行结构域预测，发现Toll-1有3个富含亮氨酸重复(Leucine-rich repeats，LRR)、3个典型富含亮氨酸重复(Leucine-rich repeats typical，LRR_TYP)。Toll-3有9个富含亮氨酸重复、3个典型富含亮氨酸重复、1个富含亮氨酸重复的N端结构域(Leucine-rich repeat N-terminal domain，LRR-NT)、1个跨膜区(Transmembrane region，TR)、1个Toll-白细胞介素1抗性结构域(Toll-interleukin 1-resistance，TIR)。Toll-6有17个富含亮氨酸重复、4个典型富含亮氨酸重复、1个富含亮氨酸重复的C端结构域(Leucine-rich repeat C-terminal domain，LRR-CT)、1个富含亮氨酸重复的N端结构域、1个跨膜区、1个Toll-白细胞介素1抗性结构域。Toll-7有15个富含亮氨酸重复、6个典型富含亮氨酸重复、2个富含亮氨酸重复的C端结构域、1个富含亮氨酸重复的N端结构域、1个跨膜区、1个Toll-白细胞介素1抗性结构域。Toll-8具有3个富含亮氨酸重复、1个典型富含亮氨酸重复、1个富含亮氨酸重复的N端结构域、1个跨膜区、1个Toll-白细胞介素1抗性结构域。Toll-10具有12个富含亮氨酸重复、5个典型富含亮氨酸重复。TIR结构域长度为140个氨基酸左右，是信号传导所必需的，经序列比对发现，35个位点氨基酸高度保守(图1B)。

A：Toll蛋白结构域；B：Toll-白细胞介素1抗性结构域蛋白质序列比对。为高度保守位点，下同

在Toll-1氨基酸序列相似性方面，四纹豆象与赤拟谷盗氨基酸一致性、相似性、间隙分别为29%、50%、10%；四纹豆象与果蝇氨基酸一致性、相似性、间隙分别为29%、47%、8%。在Toll-3氨基酸序列相似性方面，四纹豆象与赤拟谷盗氨基酸一致性、相似性、间隙分别为39%、58%、2%；四纹豆象与果蝇氨基酸一致性、相似性、间隙分别为22%、42%、16%。在Toll-6氨基酸序列相似性方面，四纹豆象与赤拟谷盗氨基酸一致性高达85%，相似性高达93%，间隙为0；四纹豆象与果蝇氨基酸一致性为58%，相似性为75%，间隙为2%。在Toll-7氨基酸序列相似性方面，四纹豆象与赤拟谷盗氨基酸一致性、相似性、间隙分别为81%、89%、2%；四纹豆象与果蝇氨基酸一致性、相似性、间隙分别为56%、69%、10%。在Toll-8氨基酸序列相似性方面，四纹豆象与赤拟谷盗氨基酸一致性、相似性、间隙分别为83%、93%、0；四纹豆象与果蝇氨基酸一致性、相似性、间隙分别为51%、66%、10%。果蝇缺乏Toll-10，而四纹豆象和赤拟谷盗中都鉴定到Toll-10，二者Toll-10氨基酸一致性、相似性、间隙分别为77%、88%、0。由此可见，Toll-1、Toll-3、Toll-10、Toll-7、Toll-8、Toll-6进化速率依次降低(图2A)。

在IMD氨基酸序列相似性方面，四纹豆象与赤拟谷盗氨基酸一致性、相似性、间隙分别为42%、58%、4%；四纹豆象与果蝇氨基酸一致性、相似性、间隙分别为31%、50%、14%。在PGRP-LC氨基酸序列相似性方面，四纹豆象与赤拟谷盗氨基酸一致性、相似性、间隙分别为42%、59%、9%；四纹豆象与果蝇氨基酸一致性、相似性、间隙分别为29%、46%、14%。由此可见，IMD和PGRP-LC的进化速率与Toll-3相似(图2B)。

A：Toll进化树；B：IMD与PGRP-LC进化树

2.2 四纹豆象Toll、IMD相关基因表达量与种群密度的关系

在四纹豆象腹部组织中，Toll-1基因表达水平最低，其FPKM值为0.32。除Toll-1的表达量不受种群密度影响外(t=0.05，P=0.960)，Toll-3、Toll-6、Toll-7、Toll-8、Toll-10的表达量在高密度群体中显著或极显著上调(图3)。其中，Toll-10上调1.1倍(t=4.3，P=0.010)，Toll-8上调1.2倍(t=6.21，P=0.003)，Toll-6上调1.0倍(t=6.65，P=0.003)，Toll-3上调0.6倍(t=10.72，P=0.002)。Toll-7表达水平最高，其在高密度群体和低密度群体中的FPKM值分别为127.25、57.92，在高密度群体中上调1.2倍(t=5.67，P=0.005)。IMD和PGRP-LC的表达量未出现明显上调。

H：高密度；L：低密度。*、**分别表示高密度和低密度群体中基因表达量差异显著(P<0.05)、极显著(P<0.01)，下同

2.3 四纹豆象抗菌肽基因的鉴定与表达量分析

革兰氏阳性菌和真菌可激活昆虫的Toll信号通路进而激活抗菌肽表达，而革兰氏阴性菌通过激活IMD信号通路进而激活抗菌肽表达。抗菌肽是昆虫抵御病原体入侵的重要防线。由表2可知，从转录组中共鉴定到7个抗菌肽基因：1个Defensin(防御素基因)、1个Cecropin(天蚕素基因)、2个Apidaecin(蜜蜂抗菌肽基因)、3个Drosomycin(抗真菌肽基因)。

表2 四纹豆象抗菌肽基因序列号Tab.2 Sequence numbers of antimicrobial peptide genes in callosobruchus maculatus

在Cecropin序列相似性方面，四纹豆象与近缘物种A.luxuriosa氨基酸一致性、相似性、间隙分别为46%、67%、0，四纹豆象与果蝇氨基酸一致性、相似性、间隙分别为32%、46%、4%(图4A)。在Defensin序列相似性方面，四纹豆象与近缘物种A.luxuriosa氨基酸一致性、相似性、间隙分别为46%、73%、1%,四纹豆象与果蝇氨基酸一致性、相似性、间隙分别为32%、48%、19%。在Apidaecin-1序列相似性方面，四纹豆象与蜜蜂氨基酸一致性、相似性、间隙分别为33%、42%、13%。在Apidaecin-2序列相似性方面，四纹豆象与蜜蜂氨基酸一致性、相似性、间隙分别为28%、35%、13%。四纹豆象的Apidaecin-1与Apidaecin-2氨基酸一致性、相似性、间隙分别为30%、38%、15%。在Drosomycin-1序列相似性方面，四纹豆象与果蝇氨基酸一致性、相似性、间隙分别为82%、89%、4%。在Drosomycin-2序列相似性方面，四纹豆象与果蝇氨基酸一致性、相似性、间隙分别为69%、81%、3%。在Drosomycin-3序列相似性方面，四纹豆象与果蝇氨基酸一致性、相似性、间隙分别为86%、88%、4%。在四纹豆象的Drosomycin-1、Drosomycin-2、Drosomycin-3蛋白序列相似性方面，任意二者的一致性均为95%、相似性均为100%。在核苷酸水平上，Drosomycin-1与Drosomycin-2的一致性为93%；Drosomycin-1与Drosomycin-3的一致性为81%；Drosomycin-2与Drosomycin-3的一致性为83%(图4B)。由此可见，Drosomycin-3在进化中最保守。

在表达量方面，Apidaecin-1表达量最低，其FPKM值为6.58(图4C)。种群密度对Apidaecin-1、Cecropin和Apidaecin-2的表达量无显著影响。Drosomycin-1、Drosomycin-2、Drosomycin-3分别在高密度群体中上调6.6倍(t=7.07，P=0.002)、2.5倍(t=5.58，P=0.005)、1.8倍(t=11.70，P=0.000 3)。Defensin表达量最高，高密度群体和低密度群体的FPKM值分别为1 277.23和683.87，其在高密度群体中上调0.9倍(t=4.18，P=0.025)。

Acu：古铜异丽金龟;Adi：独角仙;Alu：Acalolepta luxuriosa;Ame：意大利蜜蜂;Bpa：Bombus pascuorum;Ctr：三开蜣螂;Hdi：东北大黑鳃金龟;Mgu：红牛头犬蚁;Orh：犀角金龟;Ppu：Pteromalus puparum;Tmo：黄粉虫;Zat：Zophob atratus

3 结论与讨论

Toll信号通路负责革兰氏阳性菌和真菌信号传导,本研究共从四纹豆象腹部转录组中鉴定到6个Toll信号通路受体基因，其蛋白质都有富含亮氨酸的结构域。其中，Toll-1进化速率较快，Toll-3进化速率略慢于Toll-1，而Toll-10、Toll-7、Toll-8、Toll-6紧随其后，进化速率依次降低。革兰氏阴性菌主要通过IMD信号通路传导。本研究从腹部转录组中鉴定到IMD信号通路的胞内关键信号分子基因IMD和受体基因PGRP-LC。IMD和PGRP-LC的进化速率与Toll-3相似。

表达量方面，除Toll-1外，Toll-3、Toll-6、Toll-7、Toll-8、Toll-10在高密度群体中上调。其中，Toll-7表达量最高。果蝇中Toll-7和Toll-10参与胚胎时期前后轴延伸[10]，Toll-8参与胚胎时期中枢神经系统和腿发育[9]。四纹豆象在高密度条件下个体发育更迅速、性成熟更早、后代胚胎发育更快速和整齐。四纹豆象腹部主要包括脂肪体和卵巢，其均参与繁殖过程。上调的Toll-3、Toll-6、Toll-7、Toll-8、Toll-10可能参与雌性个体发育、性成熟及后代的胚胎发育。与此相似，家蚕Toll基因在卵巢中高表达，其可能参与胚胎发育[11]。除调控发育功能外，Toll的重要作用是参与免疫信号转导，革兰氏阳性菌、真菌和病毒可激活Toll信号通路，从而激活抗菌肽表达。如Toll-7可激活抗病毒自噬反应[6]，通过自噬抑制病毒复制[7]。Toll-8可负调控呼吸道上皮抗微生物反应[8]。果蝇中Toll-1可明显调控免疫反应，其过表达可诱导抗菌肽表达[5]。在四纹豆象中，Toll-1表达量最低且种群密度对其表达量无显著影响，因此，Toll-1在四纹豆象种群密度引起的免疫信号转导过程中不起关键作用。种群密度对IMD和PGRP-LC表达量无明显调控作用，因此，IMD信号通路在种群密度引起的免疫信号转导中不起关键作用。由此可见，Toll-3、Toll-6、Toll-7、Toll-8、Toll-10可能在种群密度引起的免疫信号转导中具有重要作用。

革兰氏阳性菌和真菌可激活昆虫的Toll信号通路而激活抗菌肽表达，而革兰氏阴性菌通过激活IMD信号通路而激活抗菌肽表达[4]。抗菌肽是昆虫抵御病原体入侵的重要防线。本研究从转录组中共鉴定到7个抗菌肽基因： 1个Cecropin、1个Defensin、2个Apidaecin、3个Drosomycin。其中，Cecropin、Apidaecin-1和Apidaecin-2的表达量在高密度群体中无显著上调或下调，而Defensin和3个Drosomycin在高密度群体中显著上调。高种群密度通过上调Defensin和3个Drosomycin的表达量提升昆虫的预防性免疫能力，降低个体被感染的概率。Toll-3、Toll-6、Toll-7、Toll-8、Toll-10与Defensin、Drosomycin-1、Drosomycin-2、Drosomycin-3的调控关系仍不清楚，有待于进一步研究。

四纹豆象免疫信号与抗菌肽相关基因的鉴定及表达量分析有利于进一步揭示相关基因在免疫应答和个体发育中的作用，阐明种群密度介导的预防性免疫的具体分子途径。