鹌鹑ESR1基因外显子1多态性与早期生长性能的关联分析

曹 恒，杨 帅，白俊艳，樊红灯，庞有志，付学言，卢小宁，时坤鹏

(河南科技大学 动物科技学院，河南 洛阳 471023)

鹌鹑是一种古老的鸟类，在全球各地分布十分广泛，品种繁多[1]。鹌鹑的肉和蛋具有丰富的营养价值[2]，相较于乌鸡蛋和普通鸡蛋，鹌鹑蛋蛋白质含量最高，且磷脂含量也较高[3]，故有卵中佳品的美称[4]。由于影响鹌鹑生产性能和繁殖性能的因素很多，且其遗传力低[5]，通过常规选育进展较为缓慢。近年来，分子标记遗传育种的研究正蓬勃发展，成为了品种选育与改良的一大新兴技术。TSUDZUKI[6]对鹌鹑毛色、喙形、脚趾形态及蛋壳颜色等形态标记进行了研究。付晶等[7]筛选出能够准确鉴别鹌鹑性别的CHD基因标记;白俊艳等[8]和吴胜军等[9]利用微卫星标记分析了鹌鹑群体的多态性;王旭等[10]利用生物信息学方法分析了鹌鹑的EST-SSR多态性。雌激素受体基因(Estrogen receptor gene，ESR)，在1962年由JENSEN等[11]发现，其影响雌性动物的第二性征、繁殖周期、生殖力、妊娠维持等，影响胚胎发育和系统分化。通常情况下，雌激素受体有2种亚型，即ESRα和ESRβ， 分别由不同的基因编码，介导雌激素的多项效应。作为畜禽繁殖过程中的一个重要影响因子，ESR1(ESRα)基因在子宫和乳腺中起主导作用[12]。众多学者已经开展雌激素受体在人类、猪、鸡、牛、绵羊、豚鼠等动物上的研究工作[13-15]，但是ESR1基因与鹌鹑生长发育性能的关联分析未见报道，为此，以3个蛋用鹌鹑品种为受试对象，利用PCR-RFLP技术，分析ESR1基因外显子1与鹌鹑早期生长性能的关联性，以期为鹌鹑的标记选择提供依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 血液采集及基因组DNA提取 供试动物为北京白羽鹌鹑50羽、中国黄羽鹌鹑50羽、朝鲜鹌鹑50羽，采用心脏采血法进行采血，将血液储存在含有EDTA抗凝剂的真空采血管中，放至-20 ℃的冰箱进行冷冻保存以备使用。采用试剂盒法提取鹌鹑的基因组DNA，家禽全血基因组DNA提取试剂盒由郑州鼎国生物技术有限公司提供。

1.1.2ESR1基因外显子1引物合成ESR1基因外显子1引物序列参考蒲跃进[16]方法设计， 由北京鼎国昌盛生物技术有限公司合成，引物序列:F:CAAAGCCTCTGGAGTTAC，R:AGCAGTTTCCCTCAT-

CCC，预期扩增片段大小为370 bp。

1.2 试验方法

1.2.1ESR1基因外显子1的PCR扩增 反应体系共15 μL：上游引物0.6 μL，下游引物0.6 μL，DNA1.0 μL，2×TaqPCR Mix 7.5 μL，ddH2O 5.3 μL。PCR反应循环参数：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性40 s，55.4 ℃退火45 s，72 ℃延伸35 s，35个循环；72 ℃再延伸5 min。

1.2.2ESR1基因外显子1的PCR-RFLP检测ESR1引物扩增的PCR产物进行的酶切反应体系为15 μL：ddH2O 5 μL，PCR产物8 μL，限制性内切酶PvuⅡ(10 U/μL) 0.5 μL，10×Buffer 1.5 μL。混合均匀后置于37 ℃水浴消化4 h。酶切产物使用2.0%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，额定电压100 V，额定电流100 mA。电泳结束后使用凝胶成像系统进行拍照，并记录每个个体的基因型。

1.2.3ESR1基因外显子1的多态性与鹌鹑早期生长性能的关联分析 关联分析模型：yijk=μ+Bi+Mj+eijk,式中yijk为性状表型值，μ为总体均值，Bi为第i个品种效应(i=1，2，3)，Mj为第j种基因型效应，eijk为残差效应。

2 结果与分析

2.1 ESR1基因外显子1的PCR扩增产物检测

ESR1基因外显子1在3个鹌鹑群体中的PCR扩增产物检测结果见图1。从图1可以看出，检测结果为唯一的明亮条带，无杂带和脱尾现象，片段大小约为370 bp。

M.DL2000 Marker; 1—2.中国黄羽鹌鹑;3—4.北京白羽鹌鹑; 5.朝鲜鹌鹑

2.2 ESR1基因外显子1的多态性检测

图2是ESR1基因外显子1多态性在3个鹌鹑群体中的部分检测结果。从图2可以看出，ESR1基因外显子1在鹌鹑群体中能检测到3种基因型，即为TT基因型(370 bp)、CC基因型(330 bp/40 bp)和CT基因型(370 bp/330 bp/40 bp)。

M.DL2000 Marker; (A).中国黄羽鹌鹑; (B).北京白羽鹌鹑; (C).朝鲜鹌鹑;3、8为TT基因型;1、2、11、12、13、14、18为CC基因型;4、5、6、7、9、10、15、16、17为CT基因型

2.3 ESR1基因外显子1的测序分析

将鹌鹑ESR1基因外显子1的CC、CT、TT这3种基因型的PCR扩增产物进行序列测定，结果显示，在312 bp出现C/T突变，95 bp出现C/T突变，图3是95 bp处的C/T突变结果。

图3 ESR1基因外显子1的不同基因型测序结果Fig.3 Sequencing results of different genotypes of exon 1 of ESR1 gene

2.4 ESR1基因外显子1的基因频率和基因型频率

ESR1基因外显子1在3个蛋用鹌鹑群体中的基因型频率和基因频率等多态信息结果见表1。从表1可以看出，ESR1基因外显子1在中国黄羽鹌鹑、北京白羽鹌鹑、朝鲜鹌鹑中都以CC基因型频率为最高，CC基因型频率分别为0.515、0.600、0.723，ESR1基因外显子1在3个蛋用鹌鹑群体中C等位基因为优势等位基因。中国黄羽鹌鹑的遗传多样性相对较大[杂合度(He)为0.409]，北京白羽鹌鹑、朝鲜鹌鹑的遗传多样性较小。ESR1基因外显子1在朝鲜鹌鹑群体中为低度多态[多态信息含量(PIC)<0.25]，在中国黄羽鹌鹑和北京白羽鹌鹑群体为中度多态(0.25

表1 ESR1基因外显子1的遗传多态性Tab.1 Genetic polymorphism of exon 1 of ESR1 gene

2.5 ESR1基因外显子1的多态性与鹌鹑早期生长性能的关联性分析

由表2可以看出，3周龄时，朝鲜鹌鹑的CT基因型的胫长、胸骨长、体长显著高于CC基因型(P<0.05)；5周龄时，朝鲜鹌鹑的CT基因型的胸骨长和胫围显著性高于CC基因型(P<0.05)。可见，ESR1基因外显子1与朝鲜鹌鹑的胫长、胸骨长、体长、胫围有相关性(P<0.05)。

5周龄时，北京白羽鹌鹑的TT基因型体质量显著性高于CC基因型(P<0.05)。可见，ESR1基因外显子1与北京白羽鹌鹑的体质量有相关性(P<0.05)。

5周龄时，中国黄羽鹌鹑的CC基因型的体质量、胸深、胸骨长显著高于TT基因型(P<0.05)。7周龄时，中国黄羽鹌鹑CC基因型的体质量、胫长、胸深、体长显著高于TT基因型(P<0.05)。可见，ESR1基因外显子1与中国黄羽鹌鹑的体质量、胫长、胸深、体长、胸骨长有相关性(P<0.05)。

表2 ESR1基因外显子1的多态性与鹌鹑早期生长性能的关联分析Tab.2 Association of ESR1 gene exon 1 polymorphism with early growth performance in quails

注：同周龄同列数据上标不同小写英文字母表示差异显著(P<0.05)。

Note: Different lowercase letters at the same week in the same column mean the significant difference(P<0.05).

3 结论与讨论

在对家禽ESR基因多态性的研究上，季华员等[17]研究了ESR1基因在东乡绿壳蛋鸡群体中的多态性，发现在外显子1有5个突变位点，外显子4和8各有1个突变位点。王洪才等[18]研究了庄河大骨鸡ESR基因多态性，发现了CC、CD、DD基因型。周莹莹等[19]对蛋用黑羽鹌鹑ESR基因外显子的多态性进行了分析，结果表明,ESR基因外显子1、3、4、6、8中均存在多态性。本研究在3个鹌鹑品种的ESR1基因外显子1上共发现了2个突变位点，分别为C95T位点和C312T位点，检测到3种基因型(TT、CC和CT)，这与蒲跃进[16]的研究结果相同。3个鹌鹑品种的等位基因C的频率均在0.7以上，为优势等位基因，这一结果与周莹莹等[19]的结果相同。ESR1基因外显子1在3个鹌鹑品种中都有着较小的遗传多样性(He<0.5)。朝鲜鹌鹑群体为低度多态(PIC<0.25)，中国黄羽鹌鹑和北京白羽鹌鹑群体为中度多态(0.25

畜禽的繁殖性能(产蛋数和产仔数)是畜禽重要的经济性状，对于母畜来说一般也将其繁殖性能作为目标性状进行选种。家禽体内的雌激素具有控制排卵期卵泡的生长及卵黄的生成、参与蛋壳形成及产卵活动、刺激鸡输卵管发育等功能。ESR基因作为雌激素发挥作用的重要因子，同样参与了雌激素作用的生理过程。因此，国内外对ESR基因的研究主要集中在与畜禽繁殖性能的关联上，于吉英等[20]研究表明，ESR基因的多态性与300日龄文昌鸡产蛋数存在显著性相关(P<0.05)。王文涛等[21]研究发现，ESR基因对黔东南小香鸡的产蛋性状具有显著性的影响(P<0.05)。王洪才等[18]研究发现，庄河大骨鸡ESR基因多态性与产蛋数、蛋料比存在关联性(P<0.05)。周莹莹等[19]研究发现，ESR基因外显子1与蛋用黑羽鹌鹑的开产日龄存在显著的相关性(P<0.05)。蒲跃进[16]研究发现，ESR基因外显子1与鹌鹑的开产日龄存在显著的相关性(P<0.05)。曹晶晶[22]研究表明，ESR基因影响苏太猪的产仔数和初生窝质量(P<0.05)。胡闪耀[23]研究表明，ESR基因影响大白猪的总产仔数和初生窝质量(P<0.05)。

对于ESR基因与早期生长性能的研究并不多，王宵燕等[24]研究发现，苏姜猪的ESR基因的AA基因型体长显著高于BB基因型(P<0.05)，且体高、胸围、体质量极显著高于BB基因型(P<0.01)。刘卫东[25]研究表明，ESR基因对赣系大白猪和皖系大白猪的日增质量有显著影响(P<0.05)，而对体高、体长、胸围无显著影响。李隐侠[26]研究发现，在苏淮猪群体中ESR基因的各基因型对早期生长性能的影响无显著差异(P>0.05)。可见，ESR基因对不同品种猪早期生长性能的影响也是不同的。本研究发现，ESR1基因外显子1与朝鲜鹌鹑的胫长、胸骨长、体长、胫围有相关性(P<0.05)，与北京白羽鹌鹑的体质量有相关性(P<0.05)，与中国黄羽鹌鹑的体质量、胫长、胸深、体长、胸骨长有相关性(P<0.05)。可见，ESR1基因外显子1在不同鹌鹑品种中对早期生长性能的影响也不同。朝鲜鹌鹑、北京白羽鹌鹑和中国黄羽鹌鹑是蛋用鹌鹑，在选种时首先考虑其产蛋数这一繁殖性能外，还要兼顾其体质量、体长、胸骨长等生长性能。因此，ESR1基因外显子1可作为候选基因应用于蛋用鹌鹑早期生长性能的分子标记辅助选择。