国内外小麦种质抗条锈病评价及相关基因分子检测

陈向东,吴晓军，胡铁柱，李笑慧，李 淦，侯开心，茹振钢

(河南科技学院 小麦中心/河南省杂交小麦重点实验室/现代生物育种河南省协同创新中心，河南 新乡 453003)

小麦是一种适应性强、分布广泛的世界性粮食作物，为人类提供的热量和蛋白质分别约占食物总热量和总蛋白质的21%和20%[1]。小麦条锈病是由小麦条锈菌(Pucciniastriiformisf.sp.tritici)引起的世界范围内严重发生的小麦病害之一，也是我国小麦生产上最重要的病害，严重威胁我国的粮食生产，一般情况下会造成小麦减产10%～30%，严重时导致小麦绝产。

近年来，条锈菌生理小种CYR32、CYR33(水源11)逐渐发展为优势小种，另外，新出现了强毒性生理小种CYR34(贵农22)，导致现有大部分小麦主栽品种丧失条锈病抗性[2]。目前，利用抗条锈病品种是防治该病最经济、有效、易行且对环境安全的措施。条锈病抗性育种的效率主要取决于高效、多样化抗源的挖掘和快速、准确的选择鉴定手段。目前，正式公布的小麦抗条锈病基因有Yr1(Yellow rust 1)—Yr79，大部分表现出小种专化型[3-4]。这些基因中对我国小麦条锈病菌主要流行生理小种CYR32和CYR33有抗性的主效基因为Yr5、Yr8、Yr10、Yr15、Yr17、Yr24、Yr26等，有潜在的利用价值[5-6]。

小麦1BS 染色体臂上含有丰富的抗条锈病基因，如已被定位的Yr10、Yr15、Yr24(YrCH42或Yr26)等，对我国当前条锈病流行生理小种具有较强的抗性[7-9]。快速、准确鉴定小麦种质资源中这些抗条锈病基因的分布情况，对于小麦安全生产、实现抗源合理布局、延缓品种抗条锈病性丧失具有重要意义。目前，研究者对国内的小麦栽培品种或农家品种中的Yr5、Yr9(1BL/1RS)、Yr10、Yr15、Yr18、Yr24、Yr26基因进行了分子检测及抗性鉴定，发现我国小麦主产区的小麦品种(系)对当前条锈菌流行小种的抗性水平普遍较低[10-12]。李峰奇等[13]对黄淮麦区126个小麦品种(系)中的Yr5、Yr9、Yr10、Yr15基因进行分子检测发现，仅有11个品种(系)对CYR32和CYR33表现免疫或近免疫，占8.73%；董淑静等[14]对河南省43个主推品种中的Yr5、Yr9、Yr10、Yr24、Yr26等基因进行检测发现，Yr10和Yr24基因均对当前生理小种CYR32和CYR33 具有良好的抗性，而Yr9基因已丧失抗性。董娜等[15]对外引39份小麦种质进行分子检测发现，含有Yr5、Yr10、Yr18基因的种质分别为21、2、6份。综上，目前的研究较少涉及对国内和国外小麦种质同时进行田间条锈病抗性鉴定及分子检测，尤其是在黄淮麦区。为此，在黄淮麦区，利用与抗条锈病基因Yr10、Yr15、Yr24共分离或紧密连锁的STS或SSR标记对124份国内外小麦种质进行分子检测和4 a的抗条锈病鉴定，扩大条锈病抗性遗传基础，以期为黄淮麦区小麦品种布局及抗条锈病品种改良提供参考。

1 材料和方法

1.1 供试材料

供试124份国内外小麦种质见表1。

1.2 小麦抗条锈病调查

所有小麦种质均种植于新乡市辉县的种质圃中,每份种质播种2行,畦埂上种诱发行(石家庄8号),常规田间管理，于2011—2012年、2012—2013年、2016—2017年和2017—2018年接种条锈菌混合小种(CYR32、CYR33)。于小麦拔节期(3月中下旬),采用孢子悬液注射法进行接种,每行接种1个分蘖。灌浆初期，调查条锈病发病情况。病级划分采用0～4级法。0(免疫型):叶上无可见症状；0;(近免疫型):叶上产生小枯斑,无孢子堆；1(高抗型):夏孢子堆小,周围有枯斑；2(中抗型):夏孢子堆小到中等大小,生在绿色组织上,周围有枯斑；3(中感型):夏孢子堆较大,周围组织有褪绿现象；4(高感型):夏孢子堆大,周围不褪绿。

表1 国内外124份小麦种质的来源

续表1 国内外124份小麦种质的来源

1.3 基因组DNA的提取及分子标记检测

小麦三叶期，取小麦幼叶，采用CTAB法提取基因组DNA[16]。用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取效果。

选用目前生产上抗性较好且已开发分子标记的抗条锈病基因Yr10、Yr15和Yr24进行分子检测。分子标记引物由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司合成，序列信息见表2。PCR扩增于ABI Gene Amp PCR System 9700型PCR仪上进行。PCR扩增反应体系为10 μL,包括2×TaqMaster Mix 9(购自北京康为世纪生物科技有限公司)5 μL，10 μmol/L上、下游特异引物各1 μL，模板DNA 50～100 ng，其余用ddH2O补足。扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃终延伸5 min，4 ℃保存。扩增产物于170 V下用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳约1 h，经银染和显影后，利用凝胶成像仪观察电泳结果并拍照保存。

表2 抗病基因、分子标记及其引物序列Tab.2 Disease-resistant genes,markers and their sequences used in this research

2 结果与分析

2.1 小麦种质中抗条锈病基因Yr10的检测分析

利用与Yr10基因共分离的STS分子标记S26M47对124份小麦种质进行检测(图1、表3)发现，32份小麦种质可扩增出目的条带,说明这些材料含有Yr10基因；其他92份材料均没有扩增出目的条带，说明这些材料不含Yr10基因，检出率为 25.81%。

1—34为小麦种质，名称见表1。M为DNA Marker，从上到下分别为1 000、750、500、250、100 bp。下同

种质名称GermplasmnameYr10Yr15Yr24病级Diseasegrade种质名称GermplasmnameYr10Yr15Yr24病级Diseasegrade济麦22Jimai22-?+0;川农19Chuannong19-?+1～2济南17Ji’nan17-?+4川育40109Chuanyu40109---4郑麦366Zhengmai366-++4内麦9号NeimaiNo.9-++3～4周麦16Zhoumai16-??4绵阳33Mianyang33+?+4周麦18Zhoumai18--?2～3安麦6号AnmaiNo.6-?+1～2周麦22Zhoumai22---1～2资麦1号ZimaiNo.1+?+1～2温麦6号WenmaiNo.6-?+4丰优7号FengyouNo.7+??4矮早781Aizao781-??4宁春38Ningchun38-?+3～4偃师4110Yanzhan4110-??4宁冬11Ningdong11+?+4内乡188Neixiang188---4新春9号XinchunNo.9+??4新宝丰7228Xinbaofeng7228-??4山前麦2号ShanqianmaiNo.2---4百农64Bainong64-?+0;张掖冬麦-1Zhangyedongmai-1-?+4百农矮抗58Bainongaikang58---1～2扬00-126Yang00-126-++4高优503Gaoyou503-?+4扬麦16Yangmai16-++4小偃22-10Xiaoyan22-10+?+4生选4号ShengxuanNo.4-++3～4山东055525Shandong055525+?+4南农9918Nannong9918-++3～4中优9507Zhongyou9507+++3～4南05Y628Nan05Y628-++4新麦26Xinmai26-++2～3南农02Y393Nannong02Y393-+?4百泉3039Baiquan3039-++4鄂麦19号EmaiNo.19---1～2师栾02-1Shiluan02-1-?+4襄麦55Xiangmai55-?+4郑育麦9987Zhengyumai9987+??2汉北麦Hanbeimai-?+4郑麦004Zhengmai004---2～3武汉麦Wuhanmai-?+3洛麦23Luomai23-?+4攀道拉Pandaola+++2兰考198Lankao198-??3～4智矮早Zhiaizao---4豫农201Yunong201---4硬质博莱特Yingzhibolaite-?+2～3浚麦99-7Xunmai99-7-++4CL0401-?+2～3新麦208Xinmai208---4CL0407(早)CL0407(Early)+?+1新麦18Xinmai18-++4OTTO(CL0419)+?+2～3荔高6号LigaoNo.6-++3～4CL0438+?+1～2西农2208Xinong2208-?+3～4CL0442+?+3～4小偃81-54Xiaoyan81-54-++4HUAYUN--?0;郑麦9023Zhengmai9023-++4PANDORA++?3济麦20号JimaiNo.20+?+4TAMOI-++1～2济麦21号JimaiNo.21+?+4CIKO+?+2～3邯6172Han6172---3～409智引1号09ZhiyinNo.1+?+0;邯4589Han4589---409智引2号09ZhiyinNo.2+?+1～2科农199Kenong199---409智引3号09ZhiyinNo.3-?+1～2鲁麦14Lumai14-??4CARMEN+?+0

续表3 小麦种质抗条锈病基因分布及抗病性鉴定

注：+.存在；-.不存在；?.不确定，只检测到1个标记。发病病级为4个年份综合结果。

Note:+. Present;-. Absent;?. Unknown，only one marker is detected.The disease grade in Tab.3 is a comprehensive result of four years.

2.2 小麦种质中抗条锈病基因Yr15的检测分析

利用与Yr15基因两翼紧密连锁的STS标记Xbarc8和SSR标记Xgwm413对124份小麦种质进行检测。结果(图2、表3)发现，Xbarc8标记检测出95份种质可扩增出260 bp的目的条带，占76.61%；Xgwm413标记检出31份种质可扩增出115 bp的目的条带,占25.00%。Xbarc8和Xgwm413标记同时检测到目的条带的种质有28份，占22.58%，说明这些种质携带Yr15基因。

图2 部分小麦种质中Yr15基因分子标记Xbarc8(A)和Xgwm413(B)的检测

2.3 小麦种质中抗条锈病基因Yr24的检测分析

利用与Yr24连锁的两侧SSR标记Xbarc187和Xgwm498检测124份小麦种质。结果(图3、表3)发现，Xbarc187标记检测出85份种质可扩增出目的条带，占68.55%；Xgwm498标记检测出97份种质可扩增出目的条带，占78.23%。Xbarc187和Xgwm498标记同时检测到目的条带的种质有80份,占64.52%，说明这些种质携带Yr24基因。

图3 部分小麦种质中Yr24基因分子标记Xbarc187(A)和Xgwm498(B)的检测

2.4 小麦种质中抗条锈病基因的分布及其抗病性评价

由表3可知，124份小麦种质中共有29份对CYR32和CYR33混合菌表现中抗及以上水平，其中，9份表现免疫或近免疫，2份表现高抗，16份表现中抗到高抗，2份表现中抗；83份种质表现感病，占总鉴定材料的66.94%，其中，4份表现中感，17份表现中感到高感，62份表现高感；12份种质表现中感到中抗，占总鉴定材料的9.68%。本研究中鉴定的抗性新种质尤其是外引种质将为我国抗条锈品种改良提供重要的种质资源。

经分子标记检测发现，携带Yr10、Yr15、Yr24基因的小麦种质分别有32、28、80份，分别占供试材料的25.81%、22.58%、64.52%。其中，29份表现中抗及以上水平的种质中，12份含有Yr10基因，包括郑育麦9987、农大189、资麦1号、攀道拉、CL0407(早)、CL0438、09智引1号、09智引2号、CARMEN、墨S139、莫斯科39和澳阿优1号；3份含有Yr15基因，包括TAMOI、攀道拉和澳阿优1号；22份含有Yr24基因，其中，济麦22、百农64、农大189、内麦836、云麦57、09智引1号、CARMEN和法国财富麦等8份达到免疫或近免疫水平；同时含有Yr10、Yr15、Yr24基因且表现抗病的资源有攀道拉和澳阿优1号。周麦22、百农矮抗58、新麦19、鄂麦19号、HUAYUN和MRYC等6份材料未检测到上述基因(分子标记)的存在，其抗性可能受其他基因控制。

3 结论与讨论

利用现有与Yr基因共分离或紧密连锁的SCAR、STS和SSR等分子标记快速、准确鉴定生产品种对条锈病的抗性水平及其携带Yr基因种类，对于小麦安全生产、实现抗源合理布局及品种抗性改良具有重要意义。本研究发现，92份国内小麦种质中有13份、32份国外小麦种质中有16份种质对条锈菌混合小种(CYR32、CYR33)表现出较高的稳定抗性，共占供试材料的23.39%；携带Yr10、Yr15、Yr24基因的小麦种质分别有32、28、80份，分别占供试材料的25.81%、22.58%、64.52%。李峰奇等[13]对126份中国黄淮麦区重要的小麦品种(系)进行抗条锈病基因分子检测发现 ，携带Yr9基因的小麦材料所占比例最高(占41.6%)，Yr5、Yr10、Yr15和Yr26基因的分布频率较低，而Yr9基因已丧失对生理小种CYR32和CYR33的抗性。韩德俊等[19]以Yr5、Yr9、Yr10、Yr15、Yr18和Yr26等已知抗条锈病基因的分子标记对1 980份小麦地方品种和国外种质进行分子检测及抗条锈病性鉴定，发现50份抗病材料中仅有2份材料可能携带Yr10基因，未发现携带Yr5、Yr15和Yr26的材料。说明我国主产区小麦品种及地方品种抗条锈病优势生理小种CYR32和CYR33的水平依然较低，今后需要加大力度筛选、利用国外优异抗源改良现有品种抗性。

抗病育种策略是使生产品种具有尽可能广泛而稳定的抗病遗传基础，抗病基因的有效组合，将会提高品种抗病性水平，使抗病性表现更加持久[12]。本研究检测发现，含有2个或3个抗性基因(Yr10、Yr15、Yr24)的种质，如农大189、资麦1号、攀道拉和澳阿优1号等，可用于条锈病抗性改良，这对提高黄海麦区抗病品种抗性的持久性将具有较好的借鉴作用。另外，含Yr26基因的种质在育种中被广泛而单一地利用及CRY34新小种的出现，导致Yr24/Yr26抗性逐渐丧失，而Yr10和Yr15对新生理小种CRY34具有较好的免疫效果，具有较大的应用潜力[20]。建议利用Yr10、Yr15和Yr24/Yr26及其他新的有效的全生育期抗病基因开展多基因聚合育种，以提高当地小麦品种的抗条锈病性。近期研究发现，同时携带Yr15和Yr64基因的重组自交系有更好的抗性效果[21]。因此，下一步开发1BS上的Yr64分子标记,并结合Yr15、Yr10、Yr24/Yr26等基因的分子标记，对于辅助筛选新的种质资源和新生理小种抗性分子标记辅助育种具有重要意义。

利用田间表现稳定抗病性的材料鉴定新的抗病基因及分子标记对持续稳定分子标记辅助育种具有重要意义。周麦22、百农矮抗58、新麦19、鄂麦19号、MRYC和HUAYUN等种质不含Yr10、Yr15、Yr24基因，但田间表现较好的抗病性，它们可能存在其他抗条锈病基因。周麦22和矮抗58的抗病性可能来自染色体7BL上的YrZH84基因[14]；鄂麦19号采用多亲本近缘种复合杂交育种，其抗性可能来自近缘种；新麦19的检测结果与前人[14]一致，不含Yr10、Yr15、Yr24基因，但在成株期对生理小种CRY32和CRY33表现较高抗性[14]，可能存在其他抗条锈基因。