不同树脂对特殊生物样品包埋效果的比较

杨 慧 金良韵 姬 曼 孙竹林 陈大兴 赵君朋

(首都医科大学，北京 100069)

环氧树脂是透射电镜生物样品制样过程中应用最为广泛的包埋剂，为制备电镜样品提供支撑，同时起到保护样品超微结构的作用。其中Epon812和Spurr树脂是最为常用的两种树脂，已经应用几十年之久。Epon812树脂是应用最为广泛的环氧树脂，具有无可比拟的优势，例如树脂块儿聚合后体积缩小较少；对细胞超微结构保存良好；在超薄切片制备过程中具备优越的切割性能；超薄切片电镜下观察图像呈现高度反差等[1]。但Epon812树脂易吸收水分，且粘度较高，25℃下粘度为150～210cP[2]。Spon812是Epon812的直接替代产品，具有与Epon812相同的特点。与812树脂相比，Spurr树脂是一种粘度相对更低的树脂，混合树脂也只有60cP[2]，不易吸收水分，但其毒性较大，价格昂贵。Spurr树脂包埋的样品比Epon812更易于切片，但超薄切片镜下观察反差较弱[3]。有研究者建议将两种树脂混合使用，可达到良好的包埋效果[4]。

本实验室经过长时间使用Spon 812树脂和Spurr树脂进行透射电镜样品制备后发现，对于某些难于浸透的生物组织样品例如中枢神经组织中的髓鞘、糖原堆积的肝脏组织、胶原纤维丰富的血管组织，Spon 812树脂浸透不良现象时有发生。使用Spurr树脂包埋，解决了浸透不良的问题，但在超薄切片制备时需要使用二甲苯或氯仿对超薄切片反复熏蒸使切片展平；另外使用定向包埋板包埋的Spurr树脂块聚合后松脆易断，夏天尤为明显，样品的超微结构难以得到良好的保存。因此针对上述特殊样品，本实验室尝试将两种树脂结合使用对特殊样品进行浸透和包埋，通过电镜观察样品超微结构，发现混合树脂作为包埋剂使用聚合后树脂块硬度适中，易于超薄切片制备，样品渗透效果良好，超微结构清晰，图像衬度适中，同时具有两种树脂的优点，可作为日常样品包埋剂使用。

1 材料和方法

1.1 固定和取材

实验材料为具有糖、脂代谢模型小鼠的肝脏组织、正常小鼠脑组织、血管组织。实验动物经2.5%戊二醛和4%多聚甲醛灌注固定，取分别取肝、脑和腹主动脉组织，肝、脑组织切成1mm3小块，腹主动脉切成1mm长小段，采用2.5%戊二醛固定液于4℃冰箱固定2h，0.1MPB充分洗涤后待用。

1.2 组织后固定、脱水和包埋

采用浓度1%四氧化锇对上述组织进行后固定，温度设置为4℃。固定后的组织经0.1MPB缓冲液清洗、乙醇梯度脱水后分为3组。第1组，采用Spon812树脂(SPI-02660AB)浸透和包埋；第2组；采用Spurr树脂(SPI-02680AB)浸透和包埋；第3组采用Spon812与Spurr按照1∶1混合的树脂进行浸透和包埋。浸透液配制按丙酮与树脂比例以1∶1，1∶3，各浸透1h，纯树脂浸透2h。包埋树脂配方见表1、表2：

表1 Spon812树脂配方

表2 Spurr树脂配方：

按照上述配方分别配制Spon812和Spurr树脂，然后分别取等量体积的树脂充分混合后用于第3组样品组织浸透和包埋。

各组样品入包埋板后，分别加入相应新树脂。聚合过程和温度设置为37℃，过夜；45℃，8h；70℃，24h。

1.3 修块、超薄切片和染色

树脂聚合后，包埋块经修块后用Leica UC6 超薄切片机进行超薄切片制备，片厚75nm，超薄切片经常规柠檬酸铅和醋酸双氧铀染色后进行透射电镜观察。

1.4 电镜观察

使用日本电子JEM2100型透射电镜观察3组包埋样品，拍照图像的条件和放大倍数相同。

2 结果

2.1 修块和超薄切片制备比较

修块过程中发现用不同树脂制备的包埋块硬度存在差异，SPI-Pon812树脂块硬度较高，修块最为困难；Spurr树脂块硬度最低，容易切割；混合树脂则硬度和韧性介于两者之间。超薄切片制备过程中发现，SPI-Pon812树脂和混合树脂包埋样品易于制备超薄切片，脑组织和肝脏组织超薄切片舒展平整，血管超薄切片需要氯仿熏蒸展片。Spurr树脂包埋的组织样品制备的超薄切片大多需要使用氯仿熏蒸展片。

2.2 电镜观察结果比较

肝脏组织在电镜下可见肝细胞内大量糖原堆积(图1)。Spon812树脂包埋样品可见图像反差最显著，糖原聚集处可见树脂浸透不良产生的小空洞；Spurr树脂包埋样品浸透良好，但图像反差小，膜结构清晰可见；混合树脂包埋样品浸透良好，图像反差介于两种树脂单独使用之间，超微结构清晰程度优于两种树脂单独使用包埋样品获得的图像结果。

脑组织在电镜下可见髓鞘结构和大量神经纤维和突触构成的神经毡结构(图2)。Spon812树脂包埋样品髓鞘结构显著浸透不良，多见透亮空洞；突触结构、突触内小泡和膜结构可见。Spurr树脂包埋样品浸透良好，图像反差良好，可见粗面内质网、突触、突触小泡等非常清晰的结构，神经纤维内可见横切或纵切的微管结构。混合树脂包埋样品具有和Spurr树脂包埋样品相似的观察结果，两者观察效果皆优于单独使用Spon812树脂包埋样品获得的图像。

血管组织超微结构有明显的分层，可见血管内皮细胞、内皮下层和内弹性膜、平滑肌细胞等，含有大量胶原纤维和弹性纤维(图3)。Spon 812树脂包埋样组样品树脂浸透不均匀，在内皮下层和内弹性膜层超薄切片可见大量褶皱形成。Spurr树脂包埋样品组树脂浸透均匀，超薄切片几乎没有褶皱形成。而混合树脂包埋样品组浸透良好，超薄切片偶见褶皱，不影响超微结构的观察，本组超薄切片拍摄图像反差优于Spurr树脂包埋组。

图1 糖脂代谢障碍模型小鼠肝组织超微结构图像a、b图，Spon 812树脂包埋的肝组织超微结构图像，b图为a图局部放大，图像反差显著，糖原聚集处可见树脂浸透不良产生的透亮空洞，如箭头所示；可见粗面内质网、线粒体和细胞核着色较深，可见核膜。白色三角示粗面内质网，空三角示核膜，箭头所示为空洞；c、d图，Spon 812和Spurr树脂联合使用包埋的肝组织超微结构图像，d图为c图局部放大，图像反差良好；糖原聚集处可见树脂浸透均匀，粗面内质网及内质网上的核糖体(白三角所示)和核膜结构(空三角所示)非常清晰；e、f图，Spurr树脂包埋的肝组织超微结构图像，f图为e图局部放大，图像反差较弱，糖原聚集处可见树脂浸透均匀，粗面内质网(白三角所示)和核膜结构(空三角所示)可见，但反差弱，不清晰。(a、c、e图Bar=1μm，b、d、f图Bar=0.2μm)。

图2 正常小鼠小鼠脑组织超微结构图像a、b图，Spon 812树脂包埋的脑组织超微结构图像，图像整体反差显著，a图为髓鞘结构，可见树脂浸透不良产生的透亮空洞，如箭头所示；b图为高倍镜下神经纤维和突触超微结构，白色三角示突触结构内的突触小泡；c、d图，Spon 812和Spurr树脂联合使用包埋的脑组织超微结构图像，图像反差适中，c图可见髓鞘结构树脂渗透均匀，未见空洞，d图可见突触超微结构较Spon 812包埋组织的图像结构清晰，可见箭头所示神经纤维中的微管；e、f图，Spurr树脂包埋的脑组织超微结构图像，图像反差满意，e图可见髓鞘结构树脂浸透良好，f图可见白三角所示的突触结构和突触小泡，箭头所示为神经纤维中横切或纵切的微管，超微结构清晰且精细，易于辨认。(a、c、e图Bar=1μm，b、d、f图Bar=0.2μm)。

图3 小鼠腹主动脉血管组织超微结构图像a、b图，Spon 812树脂包埋的血管组织超微结构图像，b图为a图局部放大，在内膜下层和内弹性膜层可见由于树脂渗透不均产生的褶皱，如箭头所示； c、d图，Spon 812和Spurr树脂联合使用包埋的血管组织超微结构图像，d图为c图局部放大，树脂渗透较好，图像反差良好； e、f图，Spurr树脂包埋的血管组织超微结构图像，f图为e图局部放大，树脂浸透均匀，图像反差弱于树脂联合使用组。(a、c、e图Bar=2μm，b、d、f图Bar=0.2μm)。

3 讨论

用于临床诊断、研究以及科研观察的样品具有复杂多样的特点，某些样品在结构组成上存在一些特殊性，需要特殊对待处理。这就与日常工作中常规进行批量化样品包埋处理形成矛盾，导致电镜观察时才发现各种问题，其中树脂浸透不佳的问题最为多见，产生空洞或褶皱，影响超微结构观察，降低了图片质量。因此需要对包埋树脂进行一些简单易行的改进，使其兼顾普通样品和特殊样品的制样要求。

Spon 812树脂和Spurr树脂是透射电镜样品制备最为常用的两种环氧树脂，二者具有相似的切割性能。Spon812适用于大多数于动物组织、细胞样品的包埋；Spurr多用于难浸透植物样品的包埋。Spon812树脂包埋样品硬度和韧性均高于Spurr，容易制备较大超薄切片，切片平整，不需要二甲苯熏蒸展片，操作难度低。但该树脂粘度大，硬度高的特点也给样品制备带来问题，对于某些特殊样品，如本实验室在工作中遇到的质地紧密、富含髓磷脂的髓鞘板层结构、富含弹性纤维和胶原纤维的血管结构，以及糖原堆积的肝脏组织，都发现树脂渗透效果不佳。Spurr树脂包埋样品浸透效果好，易于切片，超微结构清晰精细，尤其适合作为神经组织样品的包埋剂使用。但经该树脂包埋的肝脏组织超薄切片在镜下观察反差较弱。另外，Spurr树脂价格昂贵，具有较强毒性，夏天使用时发现聚合后的树脂块酥脆易碎，在定向包埋板中聚合的树脂块尤其明显，包埋后的组织样品超微结构遭到破坏，影响观察。在超薄切片制备过程中发现，Spurr树脂包埋样品的超薄切片展片效果不佳，多需二甲苯或氯仿熏蒸促使超薄切片展平，长期使用对操作人员的健康有不良影响。

本实验室将分别配制的两种基础树脂按照1∶1体积比混合后使用可以解决特殊样品浸透不良的问题，同时避免了Spurr树脂单独使用时超薄切片展片的问题。

电镜样品制备受环境因素影响较大，不同季节、不同湿度、不同实验室，均导致环境存在差异，不同的样品类型也具有不同的特点，因此需要具体问题具体分析，有针对性的调整树脂配比的比例来满足特殊需求。

4 结论

将两种树脂按一定比例混合用于样品包埋既可以兼具两种树脂各自的优点，又能克服两种树脂各自的缺点。通过发挥它们的综合优势，可极大地提高常规批量多种生物组织包埋的效率。对于难浸透的样品和图像反差小的样品，可单独使用Spurr或Spon 812树脂来满足包埋这些特殊样品的需求。