离子色谱法测毛竹竹叶单糖和糖醛酸组成

张 强, 季红福, 周 燕, 范 煜, 葛 青, 肖竹钱, 毛建卫

(浙江省农产品化学与生物加工技术重点实验室,浙江省农业生物资源生化制造 协同创新中心,浙江科技学院 生物与化学工程学院, 浙江 杭州 310023)

木质纤维原料是地球上最丰富的可再生生物质资源，主要包括木材、农业生产废弃物、林产加工废弃物及各类能源植物。木质纤维原料主要由纤维素(22%～42%)、半纤维素(12%～27%)和木质素(11%～30%)3部分组成[1]。通过对纤维素、半纤维素和木质素的有效转化，可高选择性制备呋喃类化合物[2]、有机酸[3-4]、C5～C6糖及糖醇[5-6]、C2～C3多元醇[7]和液态烃[8-9]等化学品和燃料。功能性C5～C6糖和糖醇则来源于纤维素和半纤维素，主要包括葡萄糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖和山梨醇、木糖醇等。中国是竹资源大国，种植规模和总产量均居世界首位。竹类是重要的可再生资源，竹叶、竹枝和竹秆都有十分广阔的应用前景，如厚壁毛竹竹叶中含有大量的木质纤维，其中主要成分为半纤维素(32.26%～43.78%)和纤维素(21.89%～33.53%)[10-11]。

目前，关于木质纤维水解液中的单糖测定方法主要有气相色谱法(GC)[12-13]、高效液相色谱法(HPLC)[14-15]、离子色谱法(IC)[16-17]等。气相色谱法是将单糖与硼氢化钠进行还原反应，将还原后的单糖与乙酸酐进行乙酰化使其成为易挥发的物质进行测定，但衍生化操作复杂，且衍生化的程度不完全使得检测准确性差、重现性差;液相色谱法主要采用示差折光检测器，以乙腈和水作为流动相，凡是与流动相折光率不同的组分都有响应，但其灵敏度不高，如果样品中单糖的纯度不高，样品中的杂质可能会掩盖单糖的峰，因此液相色谱难以满足实际需要;离子色谱本质上是液相色谱的一种，可以进行离子型物质的分析与测定，糖类化合物在强碱淋洗液中呈现离子化状态，根据糖类物质pKa值的不同，可以在阴离子交换柱上被保留并得到分离。采用脉冲安培检测器，具有灵敏度高、选择性高、准确度高和重复性高的特点。

近年来，离子色谱法被广泛用于单糖的检测，该法操作简单、无需衍生化即能分析单糖和低聚糖，灵敏度高，且准确度好[18]。本研究采用Dionex ICS-5000+系统，以CarboPACTMPA10(4.0 mm×250 mm)阴离子交换柱为分离柱，脉冲安培检测器进行检测，利用梯度洗脱方法，同时考察了色谱柱温度、NaOH浓度和流速对各种单糖分离的影响。对7种常见的单糖和2种糖醛酸进行了分离与定量分析方法学的研究，建立了同时定量分析7种常见的单糖和2种糖醛酸的方法，利用该方法对磷钨酸加酶处理后的竹叶单糖组成进行了测定。

1 实 验

1.1 材料、试剂与仪器

一年生新鲜嫩毛竹竹叶(去除黄叶、烂叶)，2018年9月10日采自浙江科技学院；鼠李糖、岩藻糖、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、果糖、葡萄糖醛酸和磷钨酸标准品，阿拉丁公司；果胶酶和木聚糖酶，山东隆大生物有限公司;半乳糖醛酸、氢氧化钠和乙酸钠，均为色谱纯。

Dionex ICS-5000+离子色谱仪、电化学检测器(Au为工作电极，Ag/AgCl为参比电极)、Heraeus Multifuge X1R离心机，美国赛默飞世尔科技公司；UNIQUE-LC多功能超纯水系统，厦门锐斯捷科学仪器有限公司；水热反应釜，上海霍桐实验仪器有限公司。

1.2 色谱条件及优化

1.2.1色谱条件 CarboPACTMPA10 (4.0 mm×250 mm)阴离子交换柱,CarboPACTMPA10 (4.0 mm×50 mm)保护柱,电化学检测器以及四电位波形(清洗电极、提高检测灵敏度)。梯度淋洗程序：0～30 min,2.5%200 mmol/L NaOH和5% 200 mmo/L CH3COONa混合洗脱；30.1～53 min,50%200 mmol/L NaOH和50% 200 mmol/L CH3COONa混合洗脱；53.1～56 min,100% 200 mmol/L NaOH洗脱；56.1～60 min, 100% 200 mmol/L NaOH洗脱。

1.2.2色谱条件优化 按1.2.1节中的色谱条件，依次对淋洗液NaOH浓度(30、25、20、15、10、5和2.5 mmol/L)、淋洗液的流速(0.5、0.6、0.7、0.8、0.9和1 mL/min)和色谱柱温度(20、25、30、35和40 ℃)进行优化。

1.3 方法学研究

1.3.1标准溶液的制备 由于建立标准曲线和确认单糖出峰时间的需要，分别精密称取鼠李糖、岩藻糖、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、果糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸标准品各10 mg，置于100 mL容量瓶中，加超纯水溶解并稀释至刻度，制成质量浓度为100 mg/L的混合标准溶液。用移液枪分别移取10、50、100、300、500、700和900 μL置于10 mL容量瓶中，加超纯水稀释至刻度。制成质量浓度分别为0.1、0.5、1、3、5、7和9 mg/L的混合标准溶液，制备9 g/L的各个单糖标准溶液。

1.3.2线性关系考察 取1.3.1节储备的标准溶液，稀释成质量浓度为0.1、0.5、1、3、5、7和9 mg/L的混合标准溶液。按1.2.2节优化后色谱条件进行测定。测定7个浓度的各标准溶液，以峰面积Y为纵坐标，质量浓度X为横坐标进行线性回归，绘制每种单糖和糖醛酸的标准曲线，得到线性方程。

1.3.3检测限与定量限的考察 检测限：分析方法在规定的实验条件下所能检出被测组分的最低浓度;定量限：分析方法可定量测定被测组分中的最低浓度。将5 mg/L 混合对照品溶液逐步稀释，取25 μL 注入色谱仪，根据信噪比(S/N)3计算仪器检测限和S/N 10计算仪器定量限。

1.3.4精密度和重复性的考察 取质量浓度为9 mg/L混合对照品溶液，按1.3.1节色谱条件测定，连续进样6次，测定各标准品的峰面积，得到7种单糖和2种糖醛酸峰面积和保留时间的相对标准偏差(RSD)，根据方法学定量分析要求RSD需小于3%，以此考察仪器的精密度和重复性。

1.4 样品溶液的制备及检测

1.4.1样品溶液的制备 将新鲜采摘的竹叶洗净后，在50 ℃烘箱中烘干，进行机械粉碎，过0.45 mm筛子，备用。称取1 g竹叶粉加入20 mL 3.5%磷钨酸，150 ℃反应2 h，取出冷却，用磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲溶液调节pH值至5，分别加入100 μL果胶酶和木聚糖酶，在50 ℃下酶解7 h，8 000 r/min离心20 min中，抽滤，将提取液定容到50 mL容量瓶中。取100 μL定容到50 mL容量瓶中，经 0.22 μm 微孔滤膜过滤后按1.2.1节色谱条件进样分析。通过比较样品和标品的出峰时间，确定竹叶水解液中单糖的组成。根据竹叶水解液中单糖的峰面积和各个单糖的标准曲线，计算出竹叶水解液中单糖的浓度。

1.4.2加标回收率的考察 以样品中各个单糖的浓度为基准，分别加入1、2和4 mg/L 3个加标水平，每组试验重复3次，计算回收率以及RSD。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

2.1.1淋洗液浓度 淋洗液的浓度是影响分离效果的重要因素。调节0～30 min内淋洗液NaOH的浓度分别为30、25、20、15、10、5和2.5 mmol/L，在糖分析柱上分析含有岩藻糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、鼠李糖、木糖、果糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸的混合标准品溶液。在NaOH溶液的浓度为30、25、20、15和10 mmol/L范围内，葡萄糖和木糖2个峰有部分重叠，无法分离完全；当NaOH浓度降低为5 mmol/L 时，各个物质的峰均能得到较好的分离；当NaOH浓度降低为2.5 mmol/L时，各个物质的峰均能分离，但是出峰时间进一步的延长同时峰形更宽。因此选用5 mmol/L NaOH溶液作为淋洗液。

2.1.2淋洗液流速 改变淋洗液流速对出峰时间以及保留时间都有影响，若降低流速，则保留时间明显延长;若增加流速，则糖的分离效果随着流速增加变化较大。考察了淋洗液流速在0.5、0.6、0.7、0.8、0.9和1 mL/min范围内变化对分离效果的影响情况，结果发现：流速为0.5 mL/min时,出峰时间延后，保留时间过长，且峰形不好看;当流速为1 mL/min时出峰时间提前,保留时间缩短,分离度不够好。综合考虑，发现流速为0.8 mL/min时各组分的分离度和峰形最佳，故选择0.8 mL/min作为淋洗液流速。

2.1.3柱温 柱温是离子色谱分析的重要参数，会直接影响到单糖的分离度和组分的保留时间。将色谱柱温度分别设定为20、25、30、35和40 ℃，考察不同柱温对各个单糖分离效果的影响。发现当柱温为20 ℃时，各个单糖组分均实现基线分离。但是随着温度进一步的升高，发现单糖色谱峰出现重叠、分离度变差,故最终选择20 ℃为最佳柱温。

1.岩藻糖fucose; 2.鼠李糖rhammose; 3.阿拉伯糖arabinose;4.半乳糖galactose; 5.葡萄糖glucose; 6.木糖xylose; 7.果糖fructose; 8.半乳糖醛酸galacturonic acid;9.葡萄糖醛酸glucuronic acid

最终确定测定单糖最佳的离子色谱条件为：淋洗液NaOH浓度为5 mmol/L，淋洗液的流速为0.8 mL/min，柱温为20 ℃。以优化后的最佳条件为色谱条件对1.3.1节制备的7种单糖及2种糖醛酸的单一标准溶液和混合标准溶液进行分析检测，结果如图1所示。根据单标溶液判断出各个单糖的出峰时间，结合图1可知，7种单糖及2种糖醛酸的出峰顺序为：岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、果糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸。当分离度等于1时，相邻两峰基本分离;当分离度大于1.5说明相邻组分完全分离，由表1可知9种标准品的平均分离度都大于1.9，同时，根据方法学定量分析的要求分离度的RSD均小于3，说明这7种常见单糖及两种糖醛酸的标品得到较好的分离且重复性较好。与柴银等[16]的离子色谱检测多糖中的单糖组成的研究相比，本研究方法可以使半乳糖、葡萄糖和木糖实现完全分离。

表1 各单糖和糖醛酸分离度(9 mg/L)

1)RSD:相对标准偏差relative standard deviation

2.2 方法学研究

2.2.1线性范围、检测限(LOD)及定量限(LOQ) 取不同浓度的7种单糖及2种糖醛酸的混合标准溶液重复进样6次，考察其线性范围、检测限(LOD)及定量限(LOQ),结果如表2所示。以各单糖的质量浓度(X)为横坐标，以其对应的峰面积(Y)为纵坐标，作图得到相应的线性方程。由表2可知，岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和木糖的线性范围为0.1～9 mg/L，果糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸线性范围为0.5～9 mg/L。7种单糖及2种糖醛酸的线性方程的R2最小值为0.999 0，检测限范围0.01～1 mg/L，定量限范围0.05～3 mg/L，代表该范围内此方法具有良好的线性关系。

2.2.2精密度和重复性结果 取9 mg/L的标准混合溶液重复进样6次，通过考察峰面积和出峰时间考察其精密度和重复性。由表3可知标准品峰面积的相对标准偏差(RSD)在0.31%～0.92%内(n=6)，标准单糖保留时间的RSD在0.02%～0.80%内(n=6)。朱松等[19]采用高效阴离子色谱法检测了酱油中的单糖及双糖，在离子色谱仪相同且色谱柱优于本研究的条件下，检测方法中的RSD(1.4%～4.0%)高于本研究,且只分离出7种单糖标品。对比说明本研究的方法精密度高、重复性好。

表2 7种单糖及2种糖醛酸的线性回归方程及其参数

表3 7种单糖和2种糖醛酸峰面积和保留时间

1.阿拉伯糖arabinose; 2.半乳糖galactose; 3.葡萄糖glucose; 4.木糖xylose

2.3 样品的检测及加标回收率结果

2.3.1样品的检测 运用建立的高效阴离子色谱分析方法，对竹叶水解液进行单糖组成检测，如图2所示。竹叶水解液中4种单糖可完全分离，与图1中9种标准品色谱图保留时间对照可得，竹叶水解液是由阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和木糖组成，原料竹叶水解液中相应单糖的质量浓度分别为1.77、0.53、5.90和5.84 mg/L，以及相应单糖的质量分数为4.42%、1.34%、14.76%和14.60%。由此计算得竹叶水解液中相应单糖的物质的量比为n(阿拉伯糖)∶n(半乳糖)∶n(葡萄糖)∶n(木糖)=2.9 ∶0.7 ∶8.2 ∶9.7。

2.3.2加标回收率结果 将样品按1.4节方法进行预处理，稀释一定倍数后通过优化后的色谱条件对其进行分析。由表4可知，其加标回收率为98.53%～118.63% 均符合方法学定量要求(加标回收率范围80%～120%)，RSD为0.04%～1.16%(RSD均小于3%)，说明本方法用于实际样品测定时也具有较高的准确性。

3 结 论

为测定竹叶水解液中的单糖组成，建立了离子色谱-脉冲安培法测定岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、果糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸的方法。采用单因素试验对色谱条件进行了优化，研究结果表明：当NaOH浓度为5 mmol/L、淋洗液流速为0.8 mL/min、柱温为20 ℃时，7种单糖和2种糖醛酸可以完全分离。根据单糖和糖醛酸的pKa值的不同，通过改变条件使其达到良好的分离效果，与其它色谱检测方式具有更优越的准确度、精密度、灵敏度，且整个分析过程操作简单易行。研究发现7种单糖及2种糖醛酸的线性范围、检测限、定量限、精密度及样品的加标回收率均较为良好。同时，将建立的检测方法用于检测了毛竹竹叶水解液中的单糖组成，结果表明：竹叶水解液是由阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和木糖组成，相应单糖的质量浓度分别为1.77、0.53、5.90、5.84 mg/L，相应单糖的质量分数为4.42%、1.34%、14.76%、14.60%，相应单糖的物质的量比为2.9∶0.7∶8.2∶9.7。说明该方法可用于木质纤维基单糖的检测。

表4 不同加标浓度下分析物回收率及相对标准偏差(n=3)