续断对骨质疏松性骨折大鼠炎症因子的影响

陈磊 张莉

山东齐鲁医药学院，山东 淄博 255213

随着年龄增加，人们容易发生骨质疏松症，当骨质疏松合并骨折时，常表现出较高的骨折延迟愈合及不愈合发生率，这一直是困扰骨科治疗的问题[1]。中医药治疗骨伤历史悠久，具有不良反应少，疗效明显等优点，广泛用于骨质疏松性骨折治疗[2]。如张柳等[3]报道，麝香乌龙丸对骨质疏松大鼠股骨骨折有明显促进骨折愈合的作用。

续断为川续断科川续断属植物川续断的根。《神农本草经》将其列为上品，具有补肝肾、强筋骨、续折伤、止崩漏、安胎等功效[4]。卿茂盛等[5]报道，续断能改善骨质疏松性骨折愈合骨痂的生物力学性能，促进骨折愈合。续断促进骨折愈合的机制主要集中在通过促进成骨细胞碱性磷酸酶活性及BMP-2 的表达，提高血清碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)的活性，升高钙磷乘积，促进钙盐沉积，从而增强体内成骨。而在骨折发生时常常伴有炎症反应，有关续断对骨折愈合中的炎症反应的影响还未见报道。本实验通过分析骨质疏松骨折中炎症因子的变化，观察续断对炎症因子的影响，为续断的应用提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 试剂及仪器

续断(Xuduan)购自山东省药材公司，并经过专家鉴定为正品。续断水煎剂：续断水煎煮3次，每次1 h，煎煮液过滤，滤液合并，浓缩至相对密度1.00～1.10时，40 ℃左右加入乙醇，边加边搅拌使醇量达40%，冷藏静置48 h，离心过滤，沉淀物再用40%乙醇搅拌，冷藏静置一夜，离心过滤，滤液与上一次乙醇滤液合并，浓缩(挥去乙醇)，进一步浓缩至每毫升含生药20 g，分装，药物避光，4 ℃冰箱保存。骨源性碱性磷酸酶(bone alkaline phosphatase, BALP)试剂盒(批号：20170515)， 肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF -α)试剂盒(批号：20170421),白介素-1(Interleukin-1，IL-1β)试剂盒(批号：20170425)和白介素-6(Interleukin -6，IL-6)试剂盒(批号：20170526)，HE染色试剂盒(批号：20170225)均购自南京建成生物工程研究所。

HOLOGIC4 500 A型双能X线骨密度扫描仪(Hologic公司，美国)。徕卡病理系统(Leica公司，德国)。

1.2 动物模型制备与分组

雌性SD大鼠50只，清洁级，体质量为200～250 g，由山东省实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK(鲁)2014 0006。随机分为5组：常规骨折组、骨质疏松性骨折组、续断治疗组(高剂量组和低剂量组)、雌激素组，每组10只。一般性骨折组行假手术，其他各组大鼠行背部双侧去卵巢术切除双侧卵巢，造成骨质疏松模型。术后3个月，各组动物均用10%水合氯醛麻醉后，取右下肢股外侧切口暴露股骨干，于股骨中段用钢锯将股骨横行锯断，以直径1 mm克氏针固定，依次缝合关闭切口，建立大鼠右侧股骨中段骨折模型。根据续断临床用量为6～15 g/kg，大鼠和人的等量比值是6.3(照大鼠体表面积换算)，临床最大等效剂量为1.58 g/kg，大鼠实验常规采用临床剂量的5～30倍，7.9～47.4 g/kg，在这个范围取两个给药剂量为20 g和10 g续断生药/kg体重。雌激素组给药剂量为0.125 mg/kg体重；灌胃给药，常规骨折组和骨质疏松骨折组给予等体积的生理盐水灌胃。灌胃4周后，分别将受试大鼠采用1%戊巴比妥钠麻醉，主动脉取血，离心10 min(3 000 r/min)分离血清，-20 ℃保存备用。处死大鼠，解剖取出右侧股骨，剔净软组织后分别置双能X线骨密度仪扫描整个股骨标本，记录下骨密度数据，然后用生理盐水冲洗置股骨标本固定于4%的多聚甲醛，然后加入含5.5%EDTA的10%中性福尔马林溶液进行脱钙，待做病理检查。

1.3 观察指标

1.3.1血清BALP活性、TNF-α、IL-1和IL-6水平检测：取冰冻血清解冻，采用发色底物法测定血清 BALP活性，采用双抗夹心法测定血清TNF-α、IL-1和IL-6水平。

1.3.2HE染色观察骨痂微结构：脱钙完成后的标本进行常规的包埋、切片、脱蜡，使用苏木精原伊红染液进行染色，光镜下随机选取两组骨折线处骨痂组织高倍视野(×200)拍照，并观察骨折骨痂切面单位视野内的骨小梁、软骨细胞、骨基质等，进行组织形态学观察。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 大鼠一般情况

实验过程中各组大鼠进食饮水正常，状况良好，骨折手术时，由于受麻醉剂的影响，进食量降低，体重增长缓慢，其余时间无异常。大鼠的两次手术切口均在1 周后愈合。实验过程中均无动物死亡。

2.2 骨密度测量结果

测定各组动物的骨密度发现，骨质疏松骨折组、雌激素治疗组和续断治疗组大鼠股骨骨密度值显著低于常规骨折组(P<0.05)，提示骨质疏松造模成功；续断治疗组和常规骨折组、雌激素治疗组之间差异没有统计学意义(P>0.05)，说明续断有促进骨密度增加的作用，结果见表1。

2.3 各组大鼠血清中BALP、TNF-α、IL-1和IL-6水平

与常规骨折组比较，骨质疏松骨折组TNF-α、IL-1和IL-6水平均明显升高，BALP水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与骨质疏松骨折组比较，雌激素和续断治疗组降低了TNF-α、IL-1水平，升高IL-6水平，差异均有统计学意义(P<0.05)，其中高剂量组作用最明显，部分指标接近雌激素组，具体结果见表2。

组别 股骨骨密度/(g/cm2) 常规骨折组0.155±0.005骨质疏松骨折组0.141±0.003∗雌激素治疗组(0.125 mg/kg)0.156±0.006#续断治疗高剂量组(20 g/kg)0.155±0.005#续断治疗低剂量组(10 g/kg)0.153±0.004#

注：与常规骨折组比较，*P<0.05；与骨质疏松骨折组比较，#P<0.05。

组别BALP/(U/L)TNF-α/(ng/L)IL-1/(μg/L)IL-6/(μg/L)常规骨折组74.66±5.6792.41 ±8.76118.05±24.35935.49±32.67骨质疏松骨折组54.38±4.62∗144.32±9.78∗186.83±55.34∗1239.03±68.57∗雌激素治疗组(0.125 mg/kg)75.35 ±6.29#98.46 ±7.39#116.27±28.16#928.53±37.49#续断治疗高剂量组(20 g/kg)68.42±5.18#104.85±8.11#123.43±35.44#958.82±52.73#续断治疗低剂量组(10 g/kg)61.02±5.76#122.46±9.83#145.23±42.41#1038.26±61.22#

注：与常规骨折组比较，*P<0.05；与骨质疏松骨折组比较，#P<0.05。

2.4 病理组织学结果

骨痂组织HE染色光镜观察：常规骨折组骨小梁分布较规则，厚度均匀致密，间距小，排列有序，软骨性骨痂已逐渐被骨性骨痂取代，形成片状骨。而骨质疏松性骨折组骨小梁分布不规则，较细，髓腔间隙较大，呈疏松化表现，有炎症细胞分布。与骨质疏松性骨折组比较，雌激素治疗组和续断治疗组骨小梁数量多，形状更粗，间距更小，炎细胞较少， 软骨细胞骨化占比高，高剂量组作用最为明显，结果见图1。

图1 骨折大鼠骨痂组织HE染色(×200) A：一般骨折对照组；B：骨质疏松性骨折模型组；C：雌激素治疗组；D：续断治疗高剂量组；E：续断治疗低剂量组。Fig.1 HE results of postoperative femoral callus in rats (×200). A: The conventional fracture group; B: The osteoporotic fracture group; C: Estrogen group; D: Xuduan high dose treatment group; E: Xuduan low dose treatment group.

3 讨论

程志安等[6]报道，续断水煎剂能显著促进成骨细胞的增殖、增加碱性磷酸酶的表达及矿化结节形成的数量，促进成骨细胞骨钙素和Ⅰ型前胶原mRNA的表达。本研究发现，续断能增加血清中骨源性碱性磷酸酶水平，促进骨质疏松性骨折骨小梁数量、骨小梁厚度，软骨细胞骨化明显，促进骨折愈合。这个结果与以前的研究结果一致，显示了其强骨作用。续断主要含有三萜皂苷类、环烯醚萜类、生物碱类、黄酮类、挥发油类等[4]。刘二伟等[7]报道，水煎液中总皂苷是促进骨伤愈合的活性成分，续断乙醇提取物对成骨细胞有明显的增殖作用，说明中药续断的两种组分对成骨细胞的增殖均具有促进作用。

骨折愈合是破骨与成骨动态平衡的过程，成骨性细胞和破骨性细胞主导这个过程，而它们二者又受细胞因子作用，由于骨折是常伴有组织损伤，必然发生炎症反应，所以炎症因子常常参与骨折过程。炎性细胞因子与低骨量和骨折危险性有关，多种炎性因子包括TNF-α、IL-1等可以刺激破骨细胞分化形成[8]。本次实验也发现，骨折模型组的炎性因子TNF-α、IL-1和IL-6水平增高，证实了骨折时炎症因子升高。有关抗炎治疗，常规的抗炎药有效，其实中药也有抗炎作用。有关研究[9]表明，苦参碱、氧化苦参碱、槐果碱的抗炎免疫调节作用与它们在一定剂量范围内剂量依赖性地抑制MF经LPS刺激产生 TNF-α有关，黄芪总黄酮抗大鼠类风湿性关节炎的作用除与NO的量有关外, 也与其降低滑膜细胞内 IL-1、IL-6水平相关。

黄滨等[10]报道，续断70%乙醇提取物能显著抑制大鼠蛋清性脚肿胀、二甲苯所致的小鼠耳部炎症。本次实验发现，续断可降低TNF-α、IL-1、IL-6水平，增加骨小梁数量、骨小梁厚度，说明续断有抗炎作用，通过降低炎症因子TNF-α，IL-1对破骨细胞的刺激，降低破骨细胞的活化，从而有利于骨折愈合。续断的主要成分是三萜皂苷类、环烯醚萜类、生物碱类、黄酮类、挥发油类等，具体哪一种成分起作用还不好确定，因为这些成分都有抗炎作用的相关报道[9-10]。由于中药成分复杂，一味中药往往含有多种抗炎成分,能经多种途径达到抗炎治疗作用，所以续断可能通过多种成分共同作用发挥抗炎作用。

总之，在骨质疏松骨折愈合过程中，续断可通过多方式降低炎症因子的水平，进一步影响骨折愈合。