地塞米松干预人骨髓间充质干细胞分化的表观遗传学修饰

王鹏 王海彬,2* 徐亮亮,2 张濛 姜山

1. 广州中医药大学，广东 广州 510000 2. 广州中医药大学第一附属医院，广东 广州 510000

骨髓间充质干细胞的体外成骨分化需要地塞米松的参与，地塞米松是一种人工合成的皮质类固醇[1]。然而就Dex对未分化的间充质干细胞及成骨细胞的作用及具体机制，许多文献报道却大相径庭[2]。结合临床用药经验，低浓度Dex促进hBMSCs的成骨分化，而高浓度及长期时间的使用会促进hBMSCs的成脂分化，抑制成骨细胞的成熟，进而引起骨量丢失，导致骨质疏松的发生[3,4]。在BMSC分化过程中，糖皮质激素所起的此种双向效应潜在机制仍未得到合理解释。

表观遗传学的研究越来受到学术界的关注，它特指细胞在没有发生DNA序列改变的情况下，使得不同细胞的基因表达水平不同，可通过有丝分裂遗传，且在一定的作用下，这种基因表达是可逆的。研究表明，骨髓间充质干细胞定向分化受到表观遗传的影响，尤其在其成骨分化中，涉及到的相关成骨特异基因已被证实受到DNA甲基化和组蛋白乙酰化的调控[5]。

本研究通过观察高浓度地塞米松作用于hBMSC的表观遗传修饰及对其分化作用的影响，进而从表观遗传学角度寻找治疗激素性骨质疏松的新方法。

1 材料和方法

1.1 材料

荧光核染DAPI、荧光二抗、H3K4me3、H3K27me3抗体购自Cell Signaling公司，Dnmt1抗体购自Abcam公司；Dex购自Sigma公司，5-aza-dC购自BioVision中国。荧光定量PCR试剂盒SYBR Premix Ex TaqII购自Takara，荧光定量PCR仪采用BIO-RAD CFX96 Touch。

1.2 细胞分离和培养

成人骨髓间充质干细胞(购自Cyagen公司)用含10%胎牛血清、1%青链霉素混合液的ɑ-MEM完全培养基，放入37°、5% CO2饱和湿度的细胞培养箱中培养，使细胞贴壁，2 d换液1次，显微镜下观察细胞生长状况，当细胞汇合密度为80%左右时行常规传代处理，传细胞至P4～P5时进行后续实验。

1.3 荧光定量PCR检测

将细胞以104个/孔接种于12孔板或6孔细胞培养板中培养，次日将细胞分为空白组，不同浓度(0、1、10 μmol/L)Dex作用组，ɑ-MEM完全培养基培养，3 d后提取细胞总RNA，反转录后进行荧光定量PCR检测。结合已知3 d实验数据，另取细胞分为(0、1 μmol/L)Dex作用组及Dex+5-aza-dC (10 μmol/L)干预组，培养7 d后提取细胞总RNA，反转录后进行荧光定量PCR检测相关基因表达。引物序列见表1。

表1 RT-PCR引物列表Table 1 Primers of RT-PCR

1.4 Western-blot检测

检测经不同浓度地塞米松作用的细胞7 d后Dnmt1、H3K4me3、H3K27me3蛋白表达水平。预冷PBS洗涤6孔板中细胞2～3次，用Western-IP细胞裂解液(含1%蛋白酶抑制剂)冰上裂解细胞，刮除裂解的细胞放入1.5 mL离心管中，在4 ℃、12 000 r/min离心15 min收集上清液。BCA法测定总蛋白，取25μg蛋白行SDS-PACE凝胶电泳后，转膜至PVDF膜，5% BSA封闭，经相应一抗及二抗孵育，ECL发光法显影。

1.5 免疫荧光检测

收集经不同浓度地塞米松处理7 d后的骨髓间充质干细胞，以5 000个/mL的细胞密度接种于已放入相应大小玻片的24孔板，每组3个孔，准备爬片。24 h后将玻片取出，PBS清洗3次，每次3 min。后4%多聚甲醛固定30 min，PBS冲洗3次，每次3 min。0.3%Triton X-100(PBS配制)室温通透30 min后，PBS浸洗玻片3次，每次3 min，吸干PBS，在玻片上滴加5% BSA，室温封闭30 min。吸尽封闭液后加入(1∶400)的H3K4me3抗体/(1∶1600)的H3K27me3抗体在4 ℃下孵育过夜。PBS浸洗爬片3次，每次3 min，吸干爬片上多余液体后滴加荧光二抗(1∶1000)，湿盒中常温孵育1 h。使用DAPI 染核，盖玻片封盖样品后进行显影拍照。

1.6 统计学处理

采用SPSS 20.0进行分析，数据比较采用单因素方差(one-way ANOVA)分析，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 成人骨髓间充质干细胞鉴定及生长形态

细胞接种于培养皿后过夜贴壁，2 d左右时间开始迅速繁殖，传至P4代，细胞形态成长梭性，极性排列，见图1。鉴定报告示该细胞表面强表达CD105、CD29、CD73、CD44，不表达CD34、CD45、CD11b。成脂诱导分化14 d后，油红O染色可见标准脂滴形成；成骨诱导分化14 d后，茜素红染色可见深红色小结节；成软骨诱导分化21 d后，可见典型细胞球形态。详见附件-鉴定报告。

图1 P4代人骨髓间充质干细胞形态学特征(×250)Fig.1 Morphological characteristics of bone marrow mesenchymal stem cells on P4 generation (×250)

2.2 Dex作用成人骨髓间充质干细胞 3 d 基因mRNA表达影响

Real-time PCR示高浓度(1、10 μmol/L)地塞米松对骨髓间充质干细胞干预早期有促进其向成骨系细胞分化的作用，其中1 μmol/L组Runx2、OPG mRNA表达较0 μmol/L组升高(P<0.05)，ALP、DNMT1表达显著增加(P<0.01)；10 μmol/L组Runx2、DNMT1表达较0 μmol/L组升高(P<0.01，P<0.05)；Dex(1 μmol/L)+5-aza-dC (10 μmol/L)干预组ALP表达量较Dex(1 μmol/L)组下降(P<0.01)；RANKL表达无明显差异，见图2。

图2 不同浓度Dex及加予5-aza-dC (10 μmol/L)干预间充质干细胞3 d相关基因表达水平Fig.2 Related gene expression levels in mesenchymal stem cells treated with different concentrations of Dex and 5-aza-dC (10 μmol/L) for 3 d

2.3 Dex作用成人骨髓间充质干细胞7 d 基因mRNA及蛋白表达影响

Real-time PCR示1 μmol/L地塞米松抑制干细胞成骨分化，其中Col1a1、OPG mRNA表达较0 μmol/L组降低(P<0.05)，RANKL、DNMT1表达增加(P<0.05，P<0.01)；而Dex(1 μmol/L)+5-aza-dC (10 μmol/L)干预组，Runx2表达较Dex组升高(P<0.05)，RANKL、DNMT1表达降低(P<0.05，P<0.01)。Western-blot示1 μmol/L浓度组H3K27me3蛋白表达水平高于0 μmol/L组，H3K4me3表达量相对低于0 μmol/L组，见图3。免疫荧光检测示细胞核内H3K4me3、H3K27me3抗原-抗体复合物表达情况与Western-blot结果类似，见图4。

图3 1 μmol/L Dex及加予5-aza-dC (10 μmol/L)干预间充质干细胞7 d成骨及表观遗传相关基因及蛋白表达水平Fig.3 Osteogenic and epigenetic related gene and protein expression levels in mesenchymal stem cells treated with 1 μmol/L Dex and 5-aza-dC (10 μmol/L) for 7 d

3 讨论

糖皮质激素是临床上被广泛运用的一种免疫抑制剂，起到抗炎、抗内毒素、影响造血系统等作用。然而体内的长期使用会导致骨代谢失衡，进而快速性的骨密度下降[6]；但在体外细胞实验中，地塞米松却作为促进间充质干细胞成骨分化的必要元素之一。在经典间充质干细胞成骨与成脂肪细胞诱导分化液的配方中，低浓度(0.1 μmol/L)地塞米松通过促进Cbfal、Osterix、ALP mRNA等表达而促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化；而在成脂肪诱导分化液中，增加了10倍浓度地塞米松(1 μmol/L)可与糖皮质激素受体结合激活促脂肪转录因子-增强子结合蛋白(C/EBPS)，该蛋白能特异性激活过氧化物增殖体激活受体2(PPAR2)启动子区，进而激活该基因表达，促进脂肪细胞的生成[7]。本研究发现在高浓度地塞米松持续作用于骨髓间充质干细胞的条件下，成骨分化相关基因或转录因子如Runx2、Col1a1表达受到了明显的抑制，由此可以反向推测该时期干细胞的分化趋势已向成脂细胞倾斜，这也与临床上激素性骨质疏松症的病理过程是一致的。

骨髓间充质干细胞是成骨细胞和脂肪细胞的共享前体细胞，前体细胞的成脂趋势压制成骨分化倾向，使这种双向平衡被打破，导致骨质疏松的发生，同时这种现象不仅在激素使用的患者身上被发现，年龄的差异、微重力的影响、制动的作用等一系列与外界刺激或者环境的改变的相关因素中都有类似报道[8,9]，这与表观遗传学理论不谋而合：Bernstein等[10]发现在干细胞发育与分化过程中，转录调控因子与表观遗传修饰是紧密联系的，基因的沉默受到DNA甲基化、组蛋白乙酰化等修饰方式影响，且依靠DNMT1及伴随的组蛋白重新编码在细胞有丝分裂过程中维持下去。研究报道，在前体脂肪细胞中发现Dex可以与糖皮质激素受体结合于Runx2基因的启动子区达到抑制Runx2转录促进脂肪细胞分化的作用[11]，开启了学术界从表观遗传学角度解释糖皮质激素影响干细胞分化的大门。本研究亦证实高浓度地塞米松干预间充质干细胞后，表观遗传相关修饰蛋白如DNMT1、H3K4me3、H3K27me3的表达受到不同趋势的影响。且经5-aza-dC干预后，Real-time PCR 示ALP mRNA表达水平被部分抑制，较Dex(1 μmol/L)组明显下降；而在地塞米松持续作用下，5-aza-dC干预组Runx2、Col1a1等表达量亦得到不同程度的增加，较Dex(1 μmol/L)组明显上升，上述结果不仅与DNA甲基化对基因组基因表达起抑制作用的结论是一致的[12]，也提示DNA甲基化参与了Dex对间充质干细胞分化过程中的双向效应。

Ge等[13]提出在人脂肪干细胞(hADSC)中，Runx2启动子区H3K4me2或H3K4me3的去甲基化即可起到抑制hADSC成骨分化的作用。Hemming等[14]报道在干细胞中过表达H3K27m3甲基化转移酶EZH2可特异性调节microRNA MX1与microRNA FHL1，进而下调Runx2表达起到抑制成骨分化的作用。本研究中Western-blot及免疫荧光检测发现经1 μmol/L地塞米松处理7 d后，细胞核内H3K4me3表达水平降低，而H3K27me3升高，且Runx2 mRNA 表达明显下降，提示地塞米松持续作用所致的成骨抑制效应确与特异性影响H3K4me3/ H3K27me3表达有关。

本文研究表明，地塞米松对骨髓间充质干细胞分化的效应具有双向性，与干预时间有关，表观遗传修饰相关因子DNMT1、H3K4me3、H3K27me3也参与其作用的发生发展。这在一定程度上揭示了Dex造成骨质疏松的发病机制，有助于从表观遗传学角度寻找治疗激素性骨质疏松症的新方法。