基于Cyt-B基因鉴定肉制品中鸭源性成分的研究

刘玟妍，陈思秀，王天添，段思琪，艾金霞，王艳双，孙丽媛，*

（1.北华大学医学技术学院，吉林吉林132013；2.北华大学医学院，吉林吉林132013）

肉及肉制品是人类的营养必需品，满足人体26%的蛋白质和13%的能量需要[1]。金萍等[2]检验涉及32个生产单位的90 份样品，总不符合率为25.6%（23/90），主要以猪肉、鸭肉部分代替牛肉和羊肉；唐穗平等[3]抽样调查的50 份市售肉类制品中20%掺假，掺假源为鸡、鸭、猪3 种肉类。这些问题的出现严重干扰了我国畜肉产业，制约了肉品质量的提升，并严重损害了消费者的权益。国家标准GB2760-2014《食品添加剂使用标准》[4]明确说明了食品添加剂的使用原则，食品添加剂不得掩盖食品腐败变质，不得掩盖食品本身或者加工过程中的质量缺陷，不得以掺杂、掺假、伪造为目的而使用等。由于无法直接通过肉眼和味觉鉴别，因此，亟待建立一种特异性高、灵敏度强、高效快速的方法鉴别肉类产品中的鸭源性成分。

传统肉类鉴别方法主要依赖于形态学检验。但形态学检验具有局限性，属于主观判断，缺乏客观技术指标，准确性欠佳，不适用于肉类加工产品的鉴别。目前，国内外开展肉种鉴别的方法主要包括基于代谢物的拉曼散射光谱和红外吸收光谱技术[5-7]、基于抗体抗原的酶联免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）技术[8-9]、基于核酸的聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）技术[10-11]等。拉曼光谱的灵敏度较低，待测物需要较高的含量才可检测。近红外光谱法需要大量有代表性且测量值已知的样品建立模型，但模型不通用限制它的使用范围[12]。ELISA 技术容易受制于抗体的制备，加工过程蛋白质变性，复杂基质导致假阳性[13]。DNA 比蛋白质的耐热性强，高温处理过的肉类中仍能提出片段化的DNA，而且DNA 比蛋白质具有更丰富的种间多态性，更有利于物种鉴别[14]。近几年新兴的电子鼻和电子舌技术[15-17]虽然具有操作方便、成本低、重现性好等优点，但分析过程复杂，不适用于无相关专业技术人员检测。因此，PCR方法的应用更为广泛，也是现行国家和行业标准中指定的主要方法之一，其操作简便，可实现定性检验和高通量筛选。目前应用于动物源性成分鉴别的PCR 方法包括实时荧光定量PCR（real-time PCR）[18-19]技术、数字PCR 技术[20-21]等。但此类技术所需的仪器及配件产品价格昂贵，过程较为复杂，对试验操作要求较高，这些不足限制了将此研究结果转化为常见肉类产品DNA 鉴定试剂盒的可能性。

由于动物的线粒体DNA 种属特异性强，且在同一个体的不同组织无差异[22]，同时线粒体DNA 在每个细胞中都存在高拷贝数，即使肉品经高温等深加工处理后仍能被检出，因此常被作为分子标记的靶基因[23]。本研究以鸭及其他常见动物（牛、羊、猪、鸡、驴）的Cyt-B基因序列为基础设计并筛选特异性引物，应用PCR 技术对肉制品中鸭源性成分进行检测并克隆构建了目的基因的重组质粒，为肉类产品DNA 鉴定试剂盒的研发提供了试验基础。

1 材料与仪器

1.1 材料

试验用鸭、牛、羊、猪、鸡、驴6 种生鲜肉由长春食品药品检测中心提供及本地市场购买。

1.2 主要仪器和试剂

1.2.1 主要仪器

Q6000 核酸蛋白分析仪：美国Quawell；9700 型PCR 扩增仪：美国ABI 公司；JY-600C 型双稳定时电泳仪：北京市君意东方电泳设备有限公司；UVWHITE-2020D 紫外凝胶成像自动分析仪：美国Cold Spring 公司；GL-20G-Ⅱ型变速冷冻离心机：上海安亭科学仪器厂；JD100-3B 电子天平：沈阳龙腾电子有限公司。

1.2.2 主要试剂

Tris-HCl：GENVIEW；10 %十二烷基硫酸钠：BIOSHARP；饱和乙酸钠溶液：天津市大茂化学仪器供应站；异丙醇：天津市永大化学试剂有限公司；70%冰冻酒精：天津市风船化学试剂科技有限公司；2×Taq PCR MasterMix、100 bp Ladder Marker：天根生化科技（北京）有限公司。

吉林省中药DNA 指纹检测技术科技创新中心实验室自行研制改良十二烷基硫酸钠法动物组织DNA提取试剂盒P1～P7（P1～P3 是细胞消化液，P4～P5 是DNA 沉淀剂，P6 是DNA 洗涤剂，P7 是DNA 溶解液）。

2 方法

2.1 PCR 引物设计

从美国国立生物技术信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）数据库获取鸭、牛、羊、猪、鸡、驴物种的Cyt-B 基因序列；采用DNAStar 等相关软件进行序列比较，找出同源性较高的区域[24]，在该区域内选择引物设计的模板；使用Primer Premier 5.0 设计引物；最后用BLAST 进行比对。引物由深圳华大基因科技服务有限公司合成。特异性引物序列见表1。

表1 特异性引物序列Table 1 Sequences of specific primers

2.2 改良十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）碱变性法[25]提取DNA

高质量DNA 的快速提取是决定分子生物学试验成败的关键因素。常规SDS 法不能很好地将杂质去除干净，影响后续的分子生物学试验结果。故本实验室（吉林省中药DNA 指纹检测技术科技创新中心）自行研发了改良SDS 法动物组织DNA 提取试剂盒，具体操作步骤如下：

将试验样品进行分类标记，取50 mg 左右样品放入无菌EP（eppendorf）管中，加约1 mL 冷生理盐水溶液浸泡20 min，去除生理盐水，再浸泡，可反复2 次～3 次；然后尽量去除生理盐水，用小型组织匀浆机点式研磨（上述操作尽量在冰盒上进行，以防止DNA 降解）。4 ℃，10 000r/min 离心5 min，弃上清液。取处理样品20 mg，置于离心管中；加入P1 溶液500 μL，P2 溶液30 μL，P3 溶液15 μL 混匀，置于56 ℃水浴振荡1 h；取出后加入P4 溶液500 μL，充分混匀10 min，10 000r/min 离心10 min；取上清液加入等体积P5 溶液，-20 ℃放置1 h；10 000 r/min 离心10 min；弃上清液，沉淀中加入P6 溶液200 μL，混匀，11 000 r/min 离心10 min，重复离心1 次；弃上清液，沉淀室温（25 ℃）晾干后，加入P7 溶液100 μL 溶解DNA，轻轻混匀，作为试验样本DNA 储存液，-20 ℃冰箱保存备用。

2.3 肉样DNA 基因组浓度和纯度检测

DNA 链上碱基的苯环结构在紫光区具有较强吸收，其吸收峰在260 nm 处，当DNA 样品中含有蛋白质、酚或其他小分子污染物时，会影响DNA 吸光度的准确测定。用核酸测定仪分别测定各个样品的OD260、OD280，计算其比值衡量样品的纯度，每个样品重复测定3 次。将得到的DNA 原液稀释到约100 ng/μL，-20 ℃保存。

2.4 确立PCR 反应体系及条件

反应体系：2×Taq PCR MasterMix 10 μL，上下游引物（10 ng/μL）各0.5 μL，DNA 模板0.5 μL，二次蒸馏水8.5 μL，共20 μL。

反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30 个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

2.5 琼脂糖凝胶电泳检测

制备1.5%的琼脂糖凝胶（琼脂糖1.2 g，1×Tris-硼酸缓冲液80 mL），待所有琼脂糖均完全融化，液体澄清，加入GelRed 7 μL。胶冷却后4 μL 点样。在电压85 V，电流60 mA 的条件下电泳80 min。

2.6 特异性试验

为了检验各引物PCR 特异性，在一批次PCR 反应中同时对目标物种和其他参考物种进行检测。一组加入鸭、牛、羊、猪、鸡、驴模板及各自引物作为阳性对照组（引物及模板量提升至1 μL，以二次蒸馏水补齐至20 μL），另一组加入鸭、牛、羊、猪、鸡、驴模板及所设计的鸭特异性引物作为试验组。同时将鸭肉与牛肉1 ∶1 质量比混合提取DNA、鸭肉与羊肉1 ∶1 质量比混合提取DNA 制备鸭牛混合模型和鸭羊混合模型，与前文方法相同设立对照组和试验组。琼脂糖凝胶电泳分析。

2.7 灵敏度试验

检测体系的灵敏度是指该检测体系可以进行稳定检测的最低质量浓度。本试验将制备的鸭肉样的DNA 模板（100 ng/μL）倍比稀释，依次为1×102、1×101、1×100、1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4、1×10-5ng/μL，每个稀释度各取2 μL 作为模板进行PCR 扩增，同时以双蒸水代替DNA 模板设置阴性对照，琼脂糖凝胶电泳分析。

2.8 PCR 产物克隆

凝胶回收：切取特异性试验得到的琼脂糖凝胶中鸭的条带（对照组及试验组），称取重量为0.398 g，使用TIANgel Midi Purification Kit（普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒）对样本进行凝胶回收。由于后续做测序，即使用二次蒸馏水做洗脱液，并用核酸测定仪测定提取的样品DNA 浓度，鸭为8.8 ng/μL。

质粒连接：使用pGM-T 连接试剂盒对样品进行质粒连接。根据所测得的样品浓度及分子量大小计算PCR 纯化产物的加入量为4 μL。计算公式如下：

PCR 纯化产物的加入量/μL=200×bp 数/3015×浓度（凝胶回收DNA）

克隆转化：将克隆产物转入到DH5α 感受态细胞中，加入SOC 培养基增菌，将菌液滴加于LB 固体培养基上，培养菌液平板16 h。

蓝白斑筛选，提质粒：挑取白色菌落进行细菌增菌，使用TIANprep Mini Plasmid Kit 质粒小提试剂盒对样本进行质粒提取。由于后续做测序，即使用二次蒸馏水做洗脱液，并用核酸测定仪测定提取的质粒的浓度。

3 结果与分析

3.1 肉样DNA 基因组浓度和纯度检测

不同物种的DNA 纯度与浓度结果见表2。

表2 不同物种的DNA 纯度与浓度Table 2 Purity and content of DNA from different samples

肉样DNA 的OD260/OD280均在1.8～2.0 之间，DNA浓度在140 ng/μL～370 ng/μL 之间。

3.2 特异性试验

应用设计的鸭特异性引物进行试验，鸭引物PCR特异性扩增结果见图1。

图1 鸭引物PCR 特异性扩增结果Fig.1 PCR specificity amplification of the primers for duck

由图1 可知，仅鸭肉DNA 模板能扩增出大小为512 bp 的目的片段，其余肉类样本DNA 模板扩增均为阴性。

鸭牛混合模型PCR 特异性扩增结果见图2。

图2 鸭牛混合模型PCR 特异性扩增结果Fig.2 PCR specificity amplification for a mixed model of duck and cattle

由图2 可知，鸭肉与牛肉DNA 模板均扩增出大小为512 bp 和256 bp 目的片段。

鸭羊混合模型PCR 特异性扩增结果见图3。

图3 鸭羊混合模型PCR 特异性扩增结果Fig.3 PCR specificity amplification for a mixed model of duck and sheep

由图3 可知，鸭肉与羊肉DNA 模板均扩增出大小为512 bp 和317 bp 目的片段。

3.3 灵敏度试验

将制备的鸭肉DNA 模板用二次双蒸水10 倍梯度稀释，得质量浓度0.000 001 ng/μL～100 ng/μL，取2 μL为模板。鸭源性DNA 灵敏度检测结果见图4。

图4 鸭源性DNA 灵敏度检测结果Fig.4 Sensitivity test of duck derived DNA

由图4 可知，PCR 扩增后，当反应体系中含鸭源性DNA 成分0.000 01 ng/μL 时，可观察到目的条带。

3.4 克隆结果测序分析

克隆质粒PCR 电泳结果见图5。

图5 克隆质粒PCR 电泳结果Fig.5 PCR electrophoresis of cloning plasmid

由图5 可知，克隆结果与预期目的条带位置一致。

鸭特异性基因片段克隆产物测序比对结果见图6。

由图6 可知，目的片段经测序后，在NCBI 上BLAST 结果表明该片段的核苷酸序列与GeneBank 中已登记的鸭物种（EU755253.1）相似性均为100%，证明所得克隆的DNA 片段即为目的基因片段。

图6 鸭特异性基因片段克隆产物测序比对结果Fig.6 Sequencing comparison results of cloned products of duck specific gene fragment

4 结论与讨论

本研究根据Cyt-B 基因中的保守序列设计鸭的特异性引物，扩增片段大小为512 bp，优化PCR 反应条件和反应体系，确定退火温度，PCR 结果通过凝胶电泳成像系统进行显现。特异性试验中仅有以鸭的DNA 为模板扩增出了特异性条带，其他肉类均无相应条带，结果为阴性，混合模型的特异性试验同时扩增出了鸭与混合其他肉种样品的特异性条带，表明设计的引物特异性强，能够检测出肉制品中鸭源性成分。目前用于动物源性成分检测的PCR 方法都十分敏感，DNA 检测的灵敏度达到了pg 级[26]，本检测体系可以对鸭肉含量为1 pg 的肉制品实现稳定检测，与范丽丽等[27]建立的针对猪肉荧光PCR 检测体系灵敏度（1 pg）及许如苏等[28]建立的针对4 种动物多重荧光PCR 检测体系灵敏度（0.01%）结果相同。目前，本研究正应用于市售牛、羊肉样品中鸭源性成分掺假的检测。

为了使分子生物学方法鉴定肉类真伪在基层广泛推广，须有稳定的阳性对照品。非官方购买的样品需鉴定真伪，而长期从食品药品监督局购买阳性对照品又会造成经济负担，且肉类容易变质，不利保存。本研究克隆构建了目的基因的重组质粒，测序分析结果表明克隆的特异性基因序列与Genbank 中相同物种（序列ID：EU755253.1）核苷酸同源性达100%，可作为阳性对照用于鉴定动物源性产品中鸭肉成分，同时也为常见肉类产品DNA 鉴定试剂盒的研制奠定了基础。