N-6甲基腺嘌呤在免疫调控中的研究进展

夏 娅，樊丹平，肖 诚*

（1.北京中医药大学，北京 100102；2.中日友好医院 临床研究所，北京 100029；3.中国医学科学院 北京协和医学院 研究生院，北京 100730）

作为遗传物质，核酸在生命系统中起着基础性的作用。表观遗传修饰广泛存在于DNA 和RNA 中，这表明核酸不仅是遗传物质，而且在各种生物过程中具有复杂的调节功能，从而在遗传、生长和疾病等各方面都具有深远的影响。RNA 的表观遗传修饰是核酸领域最重要的研究方向之一。迄今为止，已在所有生物体的RNA 中鉴定出100多种转录后修饰类型。各类RNA，包括信使RNA（mRNA），核糖体RNA（rRNA），转运RNA（tRNA）都可以发生甲基化修饰。人们开始认识到RNA 中除了基本的A、U、C 和G 之外，还存在被修饰的核苷。

N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine，m6A）是大多数真核细胞mRNA 中最普遍和最丰富的转录后修饰。在从哺乳动物体内分离得到的RNA 中，约有0.1%～0.4%的腺嘌呤是含有m6A 修饰的，占总甲基化核糖核苷酸的50%左右。m6A 修饰主要发生在RRACH（R 表示A 或G，H 表示A、C 或U）基序上，且明显聚集在终止密码子和3' 非翻译区（3'UTR）周围[1]。

m6A 修饰在哺乳动物细胞分化、胚胎发育等生物学过程以及多种疾病发生发展中发挥着重要作用。本文将综述m6A 修饰在免疫调控中的作用及研究进展。

1 m6A 修饰的调控与动态平衡

m6A 修饰是一个动态可逆的过程。在人体内，要维持m6A 含量的动态稳定，需要多种酶的共同参与，主要包括甲基转移酶和去甲基化酶。为了更好地描述，人们形象地将甲基转移酶称为编码器（writer），去甲基化酶称为消码器（eraser）。经m6A 修饰后的RNA 在读码器（reader）的作用下，将信息传递给下游，发挥对mRNA 的调控作用。

1.1 编码器

m6A 甲基化由甲基转移酶复合物催化进行。该复合物主要由甲基转移酶3（methyltransferase-like 3，METTL3）、甲基转移酶14（methyltransferase-like 14，METTL14）和Wilms 瘤相关蛋白（Wilms tumor 1 associated protein，WTAP）共同构成。METTLE3 最早于1997年在HeLa 细胞中被发现，具有SAM 结合域，是首个被鉴定为编码器成员的蛋白。METTL14 具有2 个保守的功能域：一个参与催化甲基化反应；另一个是调控蛋白相互作用。METTL3 和METTL14 彼此紧密结合，催化甲基转移到腺苷。WTAP 不具有甲基转移酶活性，其本身对m6A 甲基化没有催化活性。但它与METTL3 和METTL14 复合物相互作用，影响体内催化m6A 进行甲基化的酶的活性[2]。随着研究的深入，更多的甲基转移酶复合物成员被发现。

1.2 消码器

脂肪组织与肥胖相关蛋白（fat mass and obesity associated protein，FTO）是第一个被鉴定的去甲基化酶，它的发现表明m6A 甲基化是一种动态可逆的RNA 修饰。α-酮戊二酸依赖性双加氧酶同源物5（α-ketoglutarate-dependent dioxygenasehomolog 5，ALKBH5） 是第二个被鉴定的RNA去甲基化酶。FTO 和ALKBH5 均属于α-酮戊二酸依赖性双加氧酶家族，以Fe2+和α-酮戊二酸的化学方式催化m6A 去甲基化。据报道，FTO 和ALKBH5 具有明显的组织特异性和多样的细胞内定位。FTO 在脂肪和脑组织中高度丰富，而ALKBH5 在睾丸中高表达[3]。此外，最近的研究还发现了另一种m6A 去甲基化酶，即ALKBH3。但是ALKBH3 更倾向作用于tRNA 中的m6A，而不是mRNA 或rRNA 中的m6A[4]。

1.3 读码器

编码器和消码器的作用是在靶RNA 的特定结构域上安装或去除m6A，改变其二级或三级结构，而读码器的作用是识别并优先结合靶RNA。为了使m6A 修饰具有生物学功能，它需要被不同的读码器识别，以发挥不同的下游效应。

YT521-B 同源蛋白YTH（members of the YT521-B homology，YTH） 是目前发现的主要m6A 结合蛋白。YTHDF1 通过与起始因子相互作用来促进靶RNA 与核糖体结合，增强mRNA 翻译和蛋白质合成[5]。YTHDF2 通过选择性结合m6A 修饰的mRNA，并将其募集到mRNA 衰减位点来诱导转录产物降解。有趣的是，YTHDF3 作用具有双向性，与YTHDF1 相互作用时增强RNA 翻译，而与YTHDF2 结合会促进RNA 降解[6]。YTHDC1 有助于RNA剪接和输出。YTHDC2 可促进靶RNA 的翻译效率[7]。此外，IGF2BPs、HNRNPC、EIF3 等读码器也陆续被确定。

2 m6A 甲基化修饰对RNA 结构及功能的影响

2.1 m6A 修饰影响mRNA 剪接

转录产物mRNA 被剪接形成成熟的转录本，再从细胞核转运到细胞质，最后被翻译成蛋白质。m6A 的编码器、消码器及读码器的定位表明m6A 对mRNA 剪接起调控作用。现已确定WTAP 是一种拼接因子，敲除WTAP 或METTL3 会产生不同的转录本。FTO 通过各种作用导致mRNA 剪接发生变化。YTHDC1 通过募集和调节mRNA 前体剪接因子调节mRNA 剪接[8]。

2.2 m6A 修饰调节mRNA 稳定性

m6A 修饰对mRNA 稳定性的影响主要取决于与之结合的读码器。多项研究表明，m6A 修饰可降低RNA 稳定性。敲除胚胎干细胞中的METTL3 和METTL14 可以降低m6A 水平，增强mRNA 稳定性以减少mRNA 的衰变，从而导致靶mRNA 的表达增加，增强胚胎干细胞的自我更新能力以及维持胚胎干细胞的多能性。

2.3 m6A 修饰调控翻译

mRNA 是翻译的直接模板，m6A 通过多种机制对翻译进行调控。通过募集mRNA 稳定剂，IGF2BP 可保护目标mRNA 免受降解，同时有助于输出到细胞质后的翻译[9]。YTHDF1 募集eIF3 以直接结合5'UTR 中的单个m6A，从而促进核糖体加载，并募集43S 复合体以促进翻译[10]。在翻译过程中，YTHDF3 与核糖体40S/60S 亚基相互作用，显著提高了YTHDF1 和YTHDF3 靶向m6A 甲基化mRNA的翻译效率[11]。但过多的m6A 修饰对翻译产生负面影响。

3 m6A 在免疫调控中的作用

在编码器、消码器、读码器等关键蛋白的作用下，mRNA 上的m6A 修饰水平发生改变，从而影响其结构和生物学功能，调控生物免疫系统。尽管m6A 甲基化修饰在不同细胞中对mRNA 的作用相似，但在多种免疫细胞及各种免疫类型中仍具有不同的功能。

3.1 m6A 修饰调控免疫细胞的稳态平衡

免疫细胞的稳态平衡对于维持机体健康至关重要。多项研究表明，m6A 修饰导致的mRNA 甲基化对维持T 细胞稳态具有重要意义。T 细胞稳态是维持T 细胞库大小的重要因素，同时为适应性免疫奠定基础。细胞因子信号抑制因子（suppressor of cytokine signaling，SOCS）蛋白是JAK-STAT 信号通路的关键生理抑制剂，其家族成员SOCS1 是IL-7 信号的显著负调节因子，SOCS3 和CISH 可抑制STAT5 磷酸化和T 细胞增殖。

研究发现[12]，METTL3 可影响SOCS1、SOCS3 和CISH在细胞中的表达，从而调控IL-7 介导的JAK-STAT 信号传导和TCR 介导的ERK/AKT 信号传导之间的平衡来控制T 细胞稳态。另外，缺乏METTL3 的幼稚T 细胞表现出Th1 和Th17 细胞的减少，Th2 细胞增加，Treg 细胞相对于野生型幼稚T 细胞没有变化。然而，Tregs 中METTL3 的特异性缺失，会导致Treg 免疫抑制功能丧失和严重的自身免疫性疾病[13]。可见m6A 可能是辅助性T 细胞分化和维持各类T 细胞功能的重要调控因子。

巨噬细胞是先天免疫系统的细胞成分，几乎存在于所有组织中。研究表明，FTO 可促进M1 和M2巨噬细胞的活化。敲低FTO 可抑制NF-κB 信号通路，并降低STAT1 和PPAR-γ 的mRNA 稳定性，从而阻止巨噬细胞激活[14]。小鼠巨噬细胞M1 极化后，METTL3 被特异性上调。经siRNA转染的方法敲除METTL3 基因后，M1 巨噬细胞极化受到明显抑制，但M2 巨噬细胞极化增强。而METTL3 的过表达可大大促进M1 极化，减弱M2 极化。可见，METTL3 通过m6A 甲基化修饰mRNA 来调控巨噬细胞极化[15]。

作为专职的抗原提呈细胞，树突状细胞（dendritic cells，DC） 对连接先天性免疫应答和适应性免疫应答具有重要作用。体内实验显示，METTL3 介导的m6A 甲基化以m6A 催化活性依赖性方式促进DC 成熟，从而促进T 细胞增殖，且这一过程可能与NF-κB 信号传导有关[16]。

3.2 m6A 与抗炎症免疫

牙髓炎是由口腔细菌感染引起的一种典型的炎症性疾病。髓样分化主要反应基因88（myeloid differentiation primary response gene 88，MyD88） 参与的信号通路在牙髓炎诱导炎症介质过程中被激活。MyD88 剪切可产生MyD88L 和MyD88S 两种亚型。以往的研究表明，METTL3依赖的m6A 修饰在mRNA 剪接中起着重要作用。Feng 等发现METTL3 基因敲除促进了MYD88S 的表达，这种剪接变异抑制了炎症细胞因子的产生，可见METTL3 可能通过调节MYD88 的选择性剪接来抑制脂多糖诱导的人牙髓细胞的炎症反应[17]。此外，体外实验表明，METTL3 可以通过NF-κB 信号通路减轻脂多糖诱导的巨噬细胞炎症反应[18]。在METTL3 高表达的巨噬样细胞中巨噬细胞的增殖受到抑制，且明显降低脂多糖诱导的IL-6 和TNF-α 的产生。作为m6A 的识别蛋白，YTHDF2 也可通过调节巨噬细胞中MAP2K4 和MAP4K4 mRNA 的稳定性参与调控脂多糖刺激的炎症反应[19]。这些发现为表观遗传在自身免疫性炎症性疾病发病机制中的研究提供了新的方向。

3.3 m6A 与抗肿瘤免疫

研究表明，m6A 修饰通过多种机制参与肿瘤的发生发展过程。METTL14 通过以m6A 依赖性方式增加肿瘤抑制因子miR126 水平，抑制肝细胞癌转移。在发生转移的肝细胞癌组织中，可以观察到METTL14 水平显著降低[20]。METTL3 高表达导致肿瘤抑制因子SOCS2 的m6A 修饰增加。YTHDF2 直接识别m6A 修饰后的SOCS2 mRNA，从而诱导SOCS2 降解，促进肝细胞癌的发展[21]。在肝细胞癌中，YTHDF2 还可以改变肿瘤血管通透性影响肿瘤生长[22]。

缺氧是肿瘤微环境的常见特征。Zhang 等[23]证明低氧可以以缺氧诱导因子（hypoxia inducible factor，HIF）依赖的方式诱导乳腺癌细胞中ALKBH5 表达。ALKBH5 减少了NANOG mRNA 的m6A 修饰进而增强了其稳定性。NANOG是一种多能性因子，对于肿瘤的发生和转移是必需的。HIF依赖的ALKBH5 表达降低了缺氧微环境中m6A 的甲基化水平并促进了乳腺癌干细胞的富集。

恶性胶质瘤是最致命的原发性脑肿瘤，多种m6A 修饰蛋白参与其进展。研究表明[24]，METTL3 或METTL14 表达下调促进胶质瘤干细胞的增殖和自我更新能力，最终导致恶性胶质瘤发生。相反，抑制FTO 表达可提高m6A 水平并有效抑制胶质瘤进程。ALKBH5 通过m6A 修饰增强FOXM1 表达，从而促进胶质瘤干细胞增殖和胶质瘤进程。

此外，包含m6A 修饰的DC 还参与了肿瘤免疫逃避机制。最新一项研究表明，YTHDF1 通过识别DC 中m6A 修饰的mRNA，增强其翻译来促进DC 中溶酶体蛋白酶介导的肿瘤新抗原的降解，从而抑制DC 向T 细胞呈递肿瘤新抗原，促进肿瘤细胞逃避免疫监视[25]。这一发现提示YTHDF1 可以与DC 疫苗联合用于免疫治疗。

3.4 m6A 与抗病毒免疫

m6A 修饰与宿主的抗病毒机制有关。RNA 解旋酶DDX46 通过募集ALKBH5 降低MAVS、TRAF3 和TRAF6等编码参与抗病毒应答的信号分子RNA 上的m6A 修饰水平，阻止它们从细胞核进入细胞质，从而降低它们的翻译水平，减少I 型干扰素的产生而发挥抗病毒先天免疫应答的作用[26]。YTHDF 蛋白在CD4+T 细胞中的过表达增加了病毒复制以及HIV-1 病毒蛋白和mRNA 的表达。Kennedy 和Lichinchi 等认为，转录后m6A 修饰和YTHDF1-3 蛋白是HIV-1 感染的正调节剂[27，28]。相反，Tirumuru 等发现YTHDF1-3 是抑制因子并降低了HIV-1反转录，以抑制过表达后CD4+T细胞中的HIV-1 感染[29]。二者的差异可能是因为YTHDF1-3 在不同细胞系中的不同作用或者检测方法不同造成的。总之，m6A 甲基化可能通过调节T 细胞来间接调节宿主的抗病毒作用，这也可能为抗病毒治疗提供了新策略。

4 结语

在编码器、消码器和读码器的作用下，m6A 几乎参与了RNA 从转录到翻译的全过程，特别是mRNA 剪接、稳定和翻译。可见m6A 修饰在免疫调控中发挥着重要作用。虽然我们已经了解m6A 与炎症反应、抗病毒免疫、抗肿瘤免疫等免疫学生理病理相关，但是其中的具体机制还有待进一步研究。到目前为止，除了在癌症医学领域，只有少数研究定向于检查表观遗传学及其调节剂在免疫学和风湿病的临床适用性。因此，我们需要对m6A 进行更加深入的研究，以便更好地了解这种修饰对不同免疫性疾病的影响，发现更多潜在治疗的机会。