SLC25A13基因突变与婴儿胆汁淤积症遗传代谢病的关系

白丹

婴儿肝内胆汁淤积症属于一种肝病，儿童是高发人群，发病率达1/2 500～1/5 000[1]。相关医学研究表明，在中国遗传代谢病中，阳性率位居首位的为甲基丙二酸尿症，高危患者中阳性率位居第二位[2]。近年来新的诊断技术得到了飞速发展，但是现阶段仍然缺乏确切发病原因的婴儿肝内胆汁淤积症占总数的70%左右[3]。本研究探讨SLC25A13基因突变与婴儿胆汁淤积症遗传代谢病的关系。

资料与方法

一、一般资料

随机选取2016年8月至2018年8月四川省妇幼保健院婴儿胆汁淤积症患儿126例，将这些患儿作为研究组，另随机选取同期我院年龄段相同、具有正常肝功能、无肝炎家族史的正常婴儿100例作为对照组。

二、纳入和排除标准

纳入标准：(1)均在婴儿期起病；(2)均为肝细胞性黄疸；(3)均有肝功能损害。排除标准：(1)胆道闭锁；(2)梅毒螺旋体；(3)人类免疫缺陷病毒感染。

三、方法

(一)血串联质谱分析 运用干血滤纸片法采集患儿全血标本，在专用采血滤纸(S&S903#)上滴入，晾干后送检。用含氨基酸与酰基肉碱的甲醇萃取干血滤纸片，用盐酸正丁醇衍生后将100 μL 80%已腈加入溶解，上样检测。采用美国生物应用系统公司生产的API200型串联质谱仪、美国安捷伦公司生产的Agilent 1100型高效液相仪，采用ChemoView 1.2版本软件(美国应用生物系统公司)进行定量分析。应用串联质谱酰基肉碱血滤纸片(美国疾病控制和预防中心新生儿质控部门)，串联质谱检测的肉碱和氨基酸正常上限值取1 480例健康儿童的第99.8百分位，下限值取1 480例健康儿童的第0.002百分位，设定过程中严格依据美国CDC报告的参考值。

(二)尿气相色谱质谱有机酸分析 将研究组患儿的5～10 mL新鲜尿液收集起来，将尿素酶加入到尿样中，在37 ℃温度下进行30 min的温育，将氢氧化钠、盐酸羟胺、24酸、17烷酸、托品酸加入，混匀后在室温下进行1 h的静置，将盐酸加入，离心将上清液分取出来，将乙酸乙酯加入，离心将上清液分取出来，然后将5 mL乙酸乙酯加入，将上清液分取出来。将无水硫酸加入，离心将水分除去，再次将上清液分取出来，在60 ℃的温度下吹干，在此过程中将氮气仪充分利用起来。最后将TMCS和BSTFA混合物加入，在80 ℃的温度下进行30 min的衍生，向GCMS2QP 2010分析仪(日本岛津)中移送。

(三)基因组DNA提取 清晨将患儿的2 mL空腹外周血抽取出来，EDTA抗凝，应用天根生物科技北京有限公司生产的DNA提取试剂盒将DNA提取出来。

(四)SLC25A13基因扩增 将亚洲人中最常见的12种SLC25A13基因突变选取出来，并对引物进行设计，由上海生工生物工程有限公司合成引物(见表1)。PCR反应体系为13 μL CWBIO Premix Tap+1 μL DNA模板+0.5 μmol/L上游引物+0.5 μmol/L下游引物+ddH2O=25 μL，具体扩增条件为：外显子6、7、9、11、13、16、17均在94 ℃、94 ℃、72 ℃的温度下进行3 min的预变性、30 s的变性、1 min的延伸，分别在55 ℃、56 ℃、62 ℃、50 ℃、57 ℃、60 ℃、54 ℃的温度下退火，分别循环35次、35次、30次、40次、35次、35次、35次。

表1 PCR扩增SLC25A13外显子的基因序列

(五)PCR-SSCP 在9 μL上样缓冲液中加入3 μL PCR产物混匀，在98 ℃的温度下进行10 min的变性后以较快的速度在散冰中放置5～10 min，室温下在39∶1的非变性聚丙烯酰胺凝胶中进行5～7 h电泳，分析聚丙烯酰胺凝胶的染色和显色。用固定液浸泡电泳后的聚丙烯酰胺凝胶5～10 min，用含10%的无水乙醇+1%的冰醋酸+0.2%的AgNO3的染色液进行10 min银染，用蒸馏水进行2次漂洗，将含3%无水NaOH的显影液(将1 mL甲醛加入每200 mL溶液中)加入显色，最后将显色直接终止，在此过程中将蒸馏水直接利用起来。

(六)Citrin缺陷病基因测序分析 分析筛查研究组患儿的送检尿气相质谱、血串联质谱，直接测序分析串联质谱筛查怀疑为Citrin病的患儿，PCR-SSCP分析其余患儿，用ABI-PRISM3730测序分析PCR产物，比对SLC25A13基因正常序列(GenBank基因库)和所得序列结果，将突变位点寻找出来，同时对PCR扩增出产物进行验证，保证其为目的基因片段。直接测序PCR-SSCP未发现异常条带的外显子，从而对PCR扩增产物进行验证，保证其为目的基因片段。

结 果

一、5例疑似为新生儿肝内胆汁淤积症患儿的肝功能分析(见表2)。

二、5例考虑为Citrin缺陷病患儿血串联质谱、尿气相质谱分析

5例疑似为新生儿肝内胆汁淤积症患儿的甲硫氨酸、瓜氨酸、苏氨酸、C14-1、C16-1、苯乳酸-2、4-羟基苯乳酸均升高，1、3、4、5患儿的酪氨酸、C18-1、4-羟基苯丙酮酸均升高，1、2、3、5患儿的4-羟基苯乙酸-2均升高(见表3)。SSCP筛查其余婴儿的7个外显子PCR产物，7个外显子均无异常条带，测序均无相关的12种常见突变。

表2 5例疑似为新生儿肝内胆汁淤积症患儿的肝功能分析

表3 5例考虑为Citrin缺陷病患儿血串联质谱分析

讨 论

相关研究表明[4]，在婴儿肝内胆汁淤积症的发病中，遗传代谢发挥着一定作用。2001年筛查了日本婴儿肝内胆汁淤积症患儿的遗传代谢病[5]，结果表明，其有SLC25A13基因突变存在。现阶段临床实践证实，SLC25A13突变会引发两大类常染色体隐性遗传病，即柠檬素缺乏性新生儿肝内胆汁淤积症、II型瓜氨酸血症(CTLN2)[6-10]。本研究结果表明，5例疑似为新生儿肝内胆汁淤积症患儿的甲硫氨酸、瓜氨酸、苏氨酸、C14-1、C16-1、苯乳酸-2、4-羟基苯乳酸均升高，1、3、4、5患儿的酪氨酸、C18-1、4-羟基苯丙酮酸均升高，1、2、3、5患儿的4-羟基苯乙酸-2均升高。SSCP筛查其余婴儿的7个外显子PCR产物，7个外显子均无异常条带，测序均无相关的12种常见突变，和上述相关医学研究结果一致。

总之，SLC25A13基因突变与婴儿胆汁淤积症遗传代谢病无显著关系，值得临床重视。