脐带间充质干细胞治疗失代偿期肝硬化12例临床疗效观察

薛超 马文娜 孙庆文 李冲杰

近年来,随着干细胞研究的兴起，国内外陆续有关于干细胞临床应用的报道[1-3]，但多局限于短期的疗效观察，缺乏严格的对照。本研究对乙肝肝硬化患者采用脐带间充质干细胞经静脉输注移植联合传统的抗病毒等综合治疗方法，对其治疗后半年临床疗效进行分析，现报道如下。

资料与方法

一、一般资料

选择2017年10月至2018年3月山东医专附属医院收治的失代偿期肝硬化患者12例，其中男性8例，女性4例，年龄48～78岁，平均年龄57.4岁。12例患者均为乙型肝炎肝硬化，Child-Pugh分级：B级5例，C级7例。所有患者均行腹部B超和(或)CT 检查，实验室检查包括ALT、AST、总胆红素(TBil)、白蛋白(Alb)、胆碱酯酶(CHE)[4-6]。所有患者进行干细胞移植治疗前均给予传统控制水钠摄入、保肝、纠正低蛋白血症等内科综合治疗，所有患者在知情同意情况下签署《知情同意书》。另选择15例同时间段该院收治的失代偿期肝硬化患者，年龄46-73岁，平均年龄56.8岁，只给予传统内科综合治疗，作为对照组。

二、脐带间充质干细胞采集、分离和鉴定

(一)脐带干细胞采集 选择临沂市妇女儿童医院产科剖腹产健康产妇, 排除乙型肝炎、丙型肝炎、艾滋病、梅毒以及其他传染性疾病，无病理妊娠，胎儿娩出断脐后，清洗消毒，裁剪约15～30 cm脐带，置于装有保存液的采样瓶中，2 h内带回实验室备用。

(二)脐带干细胞分离 用贴壁法分离提取脐带间充质干细胞，提取试剂盒购自Gibco和Helios公司，耗材用品购自上海百赛生物技术有限公司。操作严格按照标准操作规程(SOP)进行分离提取，37°C、5% CO2浓度培养后，台盼蓝染色计数，每例脐带提取间充质干细胞总数不低于1×109。

(三)脐带干细胞鉴定 免疫荧光标记抗体CD29-APC、CD90-PE、CD105-FITC、CD34-PE和CD45-PerCP购自BD公司，细胞被抗体标记后上流式细胞仪进行检测，收获目的活性细胞不小于95%间充质干细胞。

三、移植方法

经计数和检测合格的细胞，洗涤3次，彻底去除培养基残留，按照5×107个/制剂的标准用生理盐水稀释制备成150 mL细胞悬液。经静脉滴注，将含有脐带间充质干细胞的150 mL生理盐水悬液注入到患者体内，滴速为45～65滴/min，连续静脉滴注3次，每次间隔1周。

四、疗效观察

观察指标主要包括以下几个方面：临床症状、体征和不良反应；干细胞移植术后1周、4周、12周、24周肝功(ALT、AST、TBil、Alb、CHE)和B超等。

五、数据分析

结 果

一、脐带间充质干细胞的鉴定

经分离培养的脐带间充质干细胞大小均匀，呈长形或梭形。经全自动细胞计数仪检测，间充质干细胞活率约为93%，高于业内85%的要求。培养细胞经流式细胞仪检测，检测结果CD29+、CD90+、CD105+、CD34-和CD45-等表面标志物提示目的细胞的比率分别为99.9%、99.9%、99.8%、99.9%和98.0%，符合目的细胞不低于95%的要求(图1)。

图1 脐带间充质干细胞表面标志物流式检测

二、临床症状与体征变化

在接受干细胞治疗的试验组患者与对照组患者中，腹水、腹胀、下肢浮肿、纳差、乏力等临床症状均有不同程度的改善，在治疗后24周左右，试验组患者改善程度高于对照组患者。此外，试验组患者中，有5例患者阐述其睡眠质量明显改善，4例患者出现面容好转。

三、肝功能变化

在干细胞治疗试验组患者和对照组患者中，肝功能指标均有不同程度的改善，在治疗后12周时，除胆碱酯酶无明显变化外，试验组肝功能指标评估改善显著高于对照组(P<0.05)，其中白蛋白变化尤为明显，预示试验组肝脏储备功能改善良好，干细胞对患者肝脏功能起到良好的修复作用。在治疗24周时，数据变化不再明显，两组患者对比差异无显著意义(P>0.05)(见表1)。

表1 患者肝功能指标变化

四、不良事件与安全性

在所有接收脐带间充质干细胞移植治疗的患者中，移植成功率100%，术后出现发热反应3例，均不超过38 ℃，未给予处理，8 h后自动消退；出现精神亢奋1例，次日恢复正常；未发生感染和白细胞下降等情形。术后跟踪随访过程中，对照组因死亡失访1例。

讨 论

已有研究证实，干细胞在肝硬化环境中能够增殖分化[8]，且已有诸多将自体骨髓干细胞应用于治疗肝硬化患者的报道[7-8]。但考虑到肝硬化患者常伴有骨髓造血功能减退及骨髓增生不良，干细胞增殖分化能力下降，骨髓穿刺采集的骨髓干细胞数量很难达到干细胞移植治疗需要的细胞数量，而且患者病情严重，患者不能耐受采集大量骨髓液，也不安全[4]。与之相比，人脐带间充质干细胞具有取材方便，来源广，数量充足，增殖分化能力强，免疫原性低，干性维持良好[9]的优势，越来越受到医生和患者的重视。

本研究对12例失代偿期肝硬化患者，使用脐带间充质干细胞进行静脉输注移植治疗，治疗后随访结果显示，接收干细胞治疗的多数患者临床症状腹水消退，腹胀、下肢浮肿减轻、食欲和体力改善明显；肝功能较治疗前也有明显好转，且较对照组改善具有显著差异性。研究结果表明，脐带间充质干细胞移植治疗能良好修复肝损伤，改善肝功能，并且安全可行，无不良风险。

目前，脐带间充质干细胞移植治疗肝硬化作为一种新的治疗方法尚处于临床探索阶段，报道的研究普遍存在病例数量较少，跟踪随访时间较短，缺乏对照和远期疗效评级不足等问题。本试验虽然设置了对照组，但也存在数量较少，跟踪时间较短等缺陷。脐带间充质干细胞移植治疗肝硬化长期疗效评价还需要大量样本和严格的对照研究，建立标准化移植方式、细胞数量等问题还需进一步研究和探讨，促进干细胞移植后的完全转化以更有效的重建和改善肝组织和肝功能也是今后研究的重点工作内容。