维生素D3治疗糖尿病肾病患者的疗效及肾组织足细胞损伤与ROS、AOPP、SOD的相关性分析

赵晔，于磊，王秀颖，董丽娜

糖尿病肾病(DN)是临床较为常见的糖尿病微血管并发症，主要以弥漫性肾小球硬化、大量蛋白尿及尿清蛋白排泄率(UAER)水平升高为临床表现[1]。而随着DN病情的不断发展，尿蛋白排泄及肾小球破坏逐渐加重，最终造成肾间质、肾小管及肾小球纤维化，是导致终末期肾病的重要影响因素[2]。范廷廷等[3]研究显示，在DN发病时，机体足细胞显著减少，且程度与蛋白尿量呈正相关，足细胞数量降低，加速了终末期肾衰竭患者的衰竭速度。研究显示，威廉姆斯肿瘤蛋白-1(WT-1)是一种主要在细胞核上表达的足细胞核蛋白；synaptopodin是主要在足细胞细胞膜上表达的特异性骨架蛋白，其表达情况可以间接反映肾组织足细胞损伤的程度[4]。另外足细胞裂孔膜蛋白(Nephrin)是一种跨膜蛋白，存在于足细胞裂孔隔膜上，在肾小球滤过功能中起着重要的作用；而足细胞标志蛋白(PCX)是足细胞损伤的标志性物质，正常情况下2种物质不在尿液中出现[5]。多项研究显示，肾脏对机体氧化应激反应较为敏感，在DN的发生发展过程中作用显著[6]。并发DN时，机体会生成更多的血清活性氧(ROS)，从而对足细胞的凋亡起到介导作用，造成PCX的脱落。Hu等[7]认为氧化应激状态对Nephrin的表达产生一定程度的影响，造成尿蛋白排泄、足细胞脱落及肾损伤的加重。故本研究分析维生素D3治疗的DN患者肾组织足细胞损伤与ROS、晚期蛋白氧化产物(AOPP)及超氧化物歧化酶(SOD)的相关性，为其临床诊治提供参考，报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2017年3月—2019年1月内蒙古自治区人民医院肾内科诊治DN患者86例作为研究对象，根据患者UAER分为大量组(UAER≥200 μg/min，n=46)和微量组(20 μg/min≤UAER<200 μg/min，n=40)2组。2组患者在性别、年龄、糖尿病病史、BMI、血压、血糖及合并症等比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性，见表1。本研究经医院伦理委员会审核批准，患者及家属知情同意并签署知情同意书。

1.2 选择标准 (1)诊断标准： ①患者空腹血糖(8 h内未进任何食物，饮水除外)>7.0 mmol/L；②伴有典型的高血糖及高血糖危象症状者，随机血糖>11.0 mmol/L；③2 h糖耐量试验血糖>11.0 mmol/L；④糖化血红蛋白含量>6.5%者；⑤可伴有不同程度的肾功能不全；⑥排除其他相关原因引起的持续性及间歇性临床蛋白尿；⑦伴有视网膜病变者；⑧肾活检确诊[8]。(2)纳入标准：①符合上述DN诊断标准者；②临床资料完整者。(3)排除标准：①合并急性、慢性炎性反应者；②妊娠、哺乳期患者；③合并其他继发性或原发性肾病者；④合并严重精神疾病、心脑血管疾病及肝脏疾病者；⑤对维生素D3过敏者；⑥6个月内应用抗氧化剂、血管紧张素受体拮抗剂等药物者；⑦依从性差，中途退出者。

1.3 治疗方法 所有患者均给予高血压和糖尿病饮食教育，治疗期间使用胰岛素维持血糖在正常水平。对于高血压患者给予适量的ARB或ACEI类药物控制血压。患者于6周洗脱期后，以骨化三醇(青岛正大海尔制药有限公司生产)0.25 μg/d口服，治疗3个月。

1.4 观察指标与方法

1.4.1 血清ROS、AOPP及SOD水平测定：于治疗前后清晨空腹抽取患者肘静脉血2 ml，离心取上清，采用比色法测定血清ROS、AOPP及SOD水平。

1.4.2 尿PCX、Nephrin水平测定：收集患者治疗前、治疗3个月后晨尿10 ml，采用酶联免疫吸附法测定PCX、Nephrin，试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司，操作方法严格按照说明书执行。

表1 2组患者基线资料比较

1.4.3 肾脏组织内synaptopodin和WT-1表达测定：采用10%甲醛对肾脏穿刺活检肾组织进行固定，石蜡切片，抗原采用95℃微波修复10 min。以小牛血清在室温下封闭20 min;再向其中加入小鼠抗人synaptopodin单克隆抗体(上海酶联生物科技有限公司)，在4℃条件下孵育12 h;采用磷酸盐缓冲液洗片5 min/次，共3次。兔抗小鼠IgG经异硫氰酸荧光素[赛默飞世尔科技(中国)有限公司]进行标记，在室温条件下孵育20 min;采用磷酸盐缓冲液洗片5 min/次，共3次;再向其中加入兔抗人WT-1多克隆抗体(北京义翘神州生物技术有限公司)，在4℃条件下孵育12 h;采用磷酸盐缓冲液洗片5 min/次，共3次。羊抗兔IgG采用罗丹明[赛默飞世尔科技(中国)有限公司]标记，在室温条件下孵育20 min。采用磷酸盐缓冲液洗片5 min/次，共3次，封片。采用激光共聚焦荧光显微镜(EVOS型, 赛默飞世尔公司)双荧光集成图像对synaptopodin和WT-1染色分布情况进行观察,并采用Imagerpro5.0图像分析软件对synaptopodin和WT-1阳性百分比进行计算。

2 结 果

2.1 2组血清ROS、AOPP及SOD水平变化 与治疗前比较，治疗3个月后2组患者血清ROS、AOPP水平均明显降低，血清SOD明显升高；与大量组比较，治疗后微量组上述指标变化更为显著(P<0.01)，见表2。

2.2 2组尿PCX及Nephrin水平变化 与治疗前比较，治疗3个月后2组患者尿PCX及Nephrin水平均明显降低；与大量组比较，治疗后微量组患者上述指标降低更为显著(P<0.01)，见表3。

2.3 2组肾脏组织内synaptopodin和WT-1表达水平比较 与治疗前比较，治疗3个月后2组患者肾脏组织内synaptopodin和WT-1表达水平均明显降低；与大量组比较，治疗后微量组患者上述指标降低更为显著(P<0.01)，见表4。

2.4 尿PCX、Nephrin与血清ROS、AOPP、SOD水平相关性分析 经Pearson相关性分析，患者尿PCX、Nephrin水平与血清ROS、AOPP呈正相关，与血清SOD呈负相关(P<0.05)，见表5。

表3 2组患者治疗前后尿PCX及Nephrin水平变化

表4 2组患者治疗前后肾脏组织内synaptopodin和WT-1表达水平比较

表5 尿PCX、Nephrin水平与血清ROS、AOPP及SOD水平的相关性分析

表2 2组患者治疗前后血清ROS、AOPP、SOD水平变化

2.5 肾脏组织内synaptopodin和WT-1与血清ROS、AOPP、SOD水平相关性分析 经Pearson相关性分析，患者synaptopodin和WT-1表达水平与血清ROS、AOPP呈正相关，与血清SOD呈负相关(P<0.05)，见表6。

表6 synaptopodin和WT-1表达水平与血清ROS、AOPP及SOD水平的相关性分析

3 讨 论

足细胞是一种终末分化的，位于肾小球脏层的上皮细胞，呈现多突状，是肾小球滤膜的重要组成部分，经分化成熟后，一般不可再生[9]。DN患者在早期发生足细胞损伤时，主要以足突融合、细胞变性肥大、足细胞密度和数量的减少为主要临床表现[10]。另外，足细胞损伤还会造成机体产生大量的蛋白尿，Nephrin是一种在足细胞裂孔膜上特异性表达的蛋白质，在肾小球机械和电荷屏障功能中发挥重要的作用，其异常表达可以一定程度反映肾脏足细胞损伤情况[11]。Zhang等[12]研究显示，早期DN患者出现Nephrin表达量代偿性增加，从而引起其膜上的骨架蛋白发生重新分布，进而引起骨架上的Nephrin蛋白逐渐脱离出来，随尿液逐渐向体外排出；另外，此时患者的肾小球屏障也遭到一定程度的破坏，形成蛋白尿。PCX是一种表达于足细胞的唾液酸黏蛋白分子，并存在于细胞顶膜位置，带负电，参与肾小球分子屏障和电荷屏障的形成[13]。Fan等[14]认为对于足细胞损伤，PCX蛋白表达情况可作为一种标志物。骨化三醇除具有钙磷代谢调节作用外，还可对RAS系统、活化免疫细胞增殖和细胞外基质沉淀起到抑制作用，改善机体应激状态，从而起到保护肾脏的作用[15]。本研究显示，对于大量和微量蛋白尿患者，骨化三醇均可减少尿PCX、Nephrin 及synaptopodin、WT-1的生成，改善机体应激反应。Zhu等[16]研究认为，高糖环境下对肾小球足细胞进行培养，可增加Col-Ⅳ蛋白、纤维连接蛋白的分泌，加入维生素D3后会缓解上述症状，改善足细胞损伤。Yang等[17]研究认为维生素D3可以抑制肾素形成、下调RAS，从而对系膜细胞增殖情况产生抑制效果，进而改善足细胞损伤。

综上所述，维生素D3可以一定程度改善DN患者足细胞损伤及氧化应激状态，且DN患者足细胞损伤与血清ROS、AOPP水平呈正相关，与血清SOD水平呈负相关，具有一定的临床应用价值。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

赵晔：整理资料，分析资料，撰写论文；于磊：修改总指导；王秀颖：收集整理资料，分析数据，图表设计；董丽娜：查找参考书籍，收集资料