替芬泰片在健康人体的耐受性及药代动力学分析

梁 弘 李 洁 吴玉春 程 楠 陈华容 吴贵辉

贵州百灵企业集团制药股份有限公司学术研发部，贵州安顺 561000

有数据显示，我国普通人群乙肝表面抗原（HBsAg）阳性率为9.09%[1]，可见我国乙型肝炎患者数量众多，若疾病控制不当，可能逐步进展为肝硬化、肝癌、肝衰竭等疾病，严重威胁着患者的生命安全[2-5]。目前临床上常用核苷类药物和干扰素治疗乙肝，但此类药物均存在效果不佳或价格昂贵等不足[6-10]。因此，新药的研发或新的治疗方法对临床治疗乙肝具有重要意义。替芬泰是从苗药马蹄金中分离制得的二肽衍生物[11]，具有与其他核苷类药物不同的抗病毒机制，主要是通过诱导机体的免疫反应发挥抗病毒的作用[12]。研究显示，替芬泰具有较好的抗乙肝病毒（HBV）的作用，同时细胞毒副作用轻，不易出现耐药性，且使用后不易出现停药反跳现象等优势，有广泛的应用前景[13-14]。动物实验显示，个体间对替芬泰的生物利用度存在较大的差异，可能与外排转运体P-糖蛋白、人结肠腺癌细胞的功能和形态等因素有关，但健康人体的不良反应及药代动力学报道较少。本研究旨在分析替芬泰片在健康人体的耐受性及其药代动力学，为其临床应用提供数据支持及理论依据，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 药品与仪器

替芬泰片（批号：20140106）是由贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室合成的纯度为99%的药物。采用Waters 2695型高效液相色谱仪（美国沃特世公司），Waters 996型二极管阵列检测器（美国沃特世公司）。

1.2 志愿者一般资料

本研究采用随机、双盲的方法于2017年1〜6月纳入26例健康志愿者作为研究对象，其中男13例，女13例；年龄22〜60岁，平均（36.52±6.68）岁。26例健康志愿者，其中2例为预实验，24例为正式实验。纳入标准：①年龄20〜60岁者；②生理各项指标正常者。排除标准：①妊娠期或哺乳期女性；②对替芬泰片中的药物相关成分过敏者；③过敏体质者。本研究经医院医学伦理委员会审核批准，健康志愿者在完全阅读并清楚研究内容及相关事项的基础上，签署知情同意书。

1.3 志愿者给药方法及血样采集

预实验人群采用替芬泰的剂量为300 mg 单、多次给药，多次给药为给药1次/d，连续给药7 d，正式实验为300 mg和600 mg 分别单、多次给药，多次给药同预实验，其中药物洗脱周期为2周。

单次给药期间，于第1 天服药前和服药后15、30、45 min，1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、8、12、24、36、48 h 采集血浆样品，于前臂静脉分别采集静脉血4 ml；多次给药期间，于第7、8、9 天服药前和第9 天服药后15、30、45 min，1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、8、12、24、36、48 h采集血浆样品，于前臂静脉分别采静脉血4 ml。血样采集后移入EDTA 抗凝管中，4℃离心5 min（3500 r/min），分离血浆，于-70℃以下冷冻保存待测。

1.4 色谱条件及血清中替芬泰及其代谢产物的检测

色谱条件：参照2010版《中国药典》[15]有关物质的测定方法，采用高效液相色谱-紫外检测器进行测定。色谱柱：RP-18（ID=250 mm×4.6 mm），测定法：流动相为甲醇-0.1%三乙胺水溶液（用稀磷酸调pH值为8.0）=65∶35。流速：1.0 ml/min；荧光检测波长为340 nm；柱温：30℃；进样量20 μl。Varian 9010型三元泵（美国瓦里安公司），VarianⅡ型荧光检测器（美国瓦里安公司），数据处理软件为Varian 系统。

抽取受试者4 ml 外周血，离心处理，采用高效液相色谱仪进行血药浓度的相关检测，检测内容包括替芬泰及替芬泰代谢产物N-苯甲酰基-O-（二甲氨基乙基）-L-酪氨酸（简称M8）和代谢物N-苯甲酰基-L-酪氨酸-O-（N-氧化-二甲氨基乙基）-L-酪氨酸（简称M9）。系统适应性试验：取供试品溶液进样，理论板数按替芬泰峰计算≥5000，替芬泰峰和各M8、M9 峰的分离度≥1.5，主峰的拖尾因子≤2.0。溶液的配制：精密称取供试品12.5 mg 到25 ml 量瓶中，用流动相超声溶解并稀释至刻度，作为供试品溶液；精密量取供试品溶液1 ml，用流动相溶解并稀释至100 ml，作为对照溶液。精密量取对照溶液20 μl，注入液相色谱仪，调节检测灵敏度使主成分峰高约为记录仪满量程的10%〜20%。再量取供试品溶液20 μl 注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的3 倍，以主成分自身对照法计算M8、M9 含量。

1.5 观察指标

采用高效液相色谱法检测不同时间点的药代动力学参数，分析药代动力学参数、高效液相色谱特征及相关不良反应。①药代动力学参数包括最高血药浓度（Cmax）、最低血药浓度（Cmin）、平均血药浓度（Cavg）、一段时间内的血药浓度曲线面积（AUC0-t）、无穷远的血药浓度曲线面积（AUC0-∞）及积累指数（accumulation index）等。②不良反应严格按照世界卫生组织（WHO）中的药物不良反应指标及相应的分级标准，观察替芬泰对机体各个系统的影响。详细记录志愿者用药期间的消化道反应、脉搏、体温、呼吸、血压等，同时对志愿者使用药物前、中、后的电解质、肝肾功能、血常规、免疫功能、尿常规、心电图等进行检查。

1.6 统计学方法

采用统计学软件SPSS 19.0分析数据，计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用t检验，以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 健康志愿者口服替芬泰的药代动力学情况

健康志愿者多次口服不同剂量的替芬泰片后，替芬泰的达峰时间（Tmax）为（1.02±0.13）h，半衰期（t1/2）为（3.08±0.09）h；M8的Tmax为（3.05±0.07）h，t1/2约为（9.56±0.67）h；M9的Tmax为（4.11±0.15）h，t1/2为（6.17±0.21）h。

2.2 健康志愿者不同剂量替芬泰单次给药和多次给药的药代动力学比较

300 mg 给药剂量下，替芬泰多次给药与单次给药的Cmax、Cmin、Cavg、AUC0-t、AUC0-∞、积累指数比较，差异无统计学意义（P＞0.05），M8和M9 多次给药的AUC0-t和AUC0-∞高于单次给药，差异有统计学意义（P＜0.05）；M9 多次给药的Cmax高于单次给药，差异有统计学意义（P＜0.05）；M8 多次给药与单次给药的Cmax、Cmin、Cavg及积累指数比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；M9 多次给药与单次给药的Cmin、Cavg及积累指数比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。600 mg 给药剂量下，替芬泰多次给药的Cmax高于单次给药，差异有统计学意义（P＜0.05）；替芬泰多次给药与单次给药的Cmin、Cavg、AUC0-t、AUC0-∞、积累指数比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；M8和M9 多次给药的Cmax和AUC0-t高于单次给药，差异有统计学意义（P＜0.05）；M9 多次给药的AUC0-∞高于单次给药，差异有统计学意义（P＜0.05）；M8 多次给药与单次给药的Cmin、Cavg、AUC0-∞及积累指数比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；M9 多次给药与单次给药的Cmin、Cavg及积累指数比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（表1）。

2.3 600 mg 给药剂量下替芬泰片、M8、M9的高效液相色谱图

600 mg 给药剂量下，多次给药使替芬泰Cmax升高，对其暴露量AUC0-∞没有显著影响（图1A）；代谢物M8和M9的Cmax升高，同时暴露量AUC0-∞增加（图1B、C）。

2.4 健康志愿者不同剂量替芬泰的不良反应情况

健康志愿者多次口服（剂量300、600 mg）替芬泰片后，600 mg 组1例志愿者发生了1次轻度咽喉部不适，有异物感的不良事件，判定为与药物无关，无志愿者因不良事件退出试验。

3 讨论

本研究结果显示，300 mg 给药剂量下，替芬泰多次给药与单次给药的Cmax、Cmin、Cavg、AUC0-t、AUC0-∞、积累指数比较，差异无统计学意义（P＞0.05），M8和M9多次给药的AUC0-t和AUC0-∞高于单次给药，差异有统计学意义（P＜0.05）；M9 多次给药的Cmax高于单次给药，差异有统计学意义（P＜0.05）；M8 多次给药与单次给药的Cmax、Cmin、Cavg及积累指数比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；M9 多次给药与单次给药的Cmin、Cavg及积累指数比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。提示300 mg 给药剂量下，多次给药对替芬泰的生物利用度和体内处置结果没有显著性影响，但会使代谢物M8和代谢物M9的体内暴露量增加。

表1 健康志愿者不同剂量替芬泰单次给药和多次给药的药代动力学比较（±s）

表1 健康志愿者不同剂量替芬泰单次给药和多次给药的药代动力学比较（±s）

不同剂量 Cmax（ng/ml）Cmin（ng/ml）Cavg（ng/ml）AUC0-t（hong/ml）AUC0-∞（hong/ml）积累指数替芬泰300 mg（n=24）单次给药多次给药t值P值替芬泰600 mg（n=24）单次给药多次给药t值P值M8 300 mg（n=24）单次给药多次给药t值P值M8 600 mg（n=24）单次给药多次给药t值P值M9 300 mg（n=24）单次给药多次给药t值P值M9 600 mg（n=24）单次给药多次给药t值P值521.21±162.72 607.13±120.18 2.523 0.332 5.03±1.53 5.12±1.49 1.528 0.581 60.06±8.42 60.11±8.31 1.957 0.504 1314.61±209.52 1436.32±211.23 2.315 0.385 1334.78±205.35 1458.78±227.83 2.204 0.397 0.98±0.21 1.08±0.25 1.912 0.521 1369.13±431.25 1769.41±636.33 4.135 0.036 5.71±2.27 5.89±2.41 2.561 0.269 151.32±51.22 159.10±50.64 1.422 0.655 3765.27±1206.33 3793.41±1218.50 1.016 0.851 3812.71±1215.24 3831.89±1207.49 1.025 0.812 0.96±0.09 1.01±0.02 2.694 0.126 1687.16±364.46 1866.28±259.55 1.877 0.524 33.07±10.25 33.85±11.44 2.663 0.158 504.16±81.25 510.41±89.70 2.715 0.089 11 514.99±2156.86 12 762.02±2335.99 5.153 0.022 11 610.96±2152.33 12 961.68±2383.29 5.249 0.021 1.18±0.13 1.27±0.20 2.155 0.412 3291.45±776.72 3763.51±939.73 4.357 0.031 81.24±20.38 85.56±23.63 2.917 0.073 1006.31±198.29 1018.96±205.47 2.592 0.245 23 158.84±4050.39 25 475.03±5021.00 5.631 0.019 23 348.32±4055.41 25 766.88±5189.90 2.416 0.348 1.11±0.21 1.19±0.23 1.633 0.549 186.91±47.64 230.65±60.48 3.856 0.041 4.68±1.43 4.91±1.59 1.314 0.717 71.24±15.98 76.66±17.20 1.369 0.696 1639.48±345.26 1908.26±417.01 4.372 0.029 1650.82±346.27 1929.91±414.66 4.679 0.025 1.09±0.23 1.14±0.22 1.489 0.617 485.53±215.66 595.31±290.18 3.719 0.045 13.61±3.66 13.97±3.89 1.945 0.516 187.39±75.66 191.38±78.08 2.014 0.487 3919.60±1282.19 4745.58±1894.35 3.814 0.043 3938.27±1282.76 4764.74±1897.03 3.926 0.039 1.01±0.04 1.09±0.09 3.126 0.067

本研究结果显示，600 mg 给药剂量下，替芬泰多次给药的Cmax高于单次给药，差异有统计学意义（P＜0.05）；替芬泰多次给药与单次给药的Cmin、Cavg、AUC0〜t、AUC0-∞、积累指数比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；M8和M9 多次给药的Cmax和AUC0-t高于单次给药，差异有统计学意义（P＜0.05）；M9 多次给药的AUC0-∞高于单次给药，差异有统计学意义（P＜0.05）；M8 多次给药与单次给药的Cmin、Cavg、AUC0-∞及积累指数比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；M9 多次给药与单次给药的Cmin、Cavg及积累指数比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究结果还显示，600 mg 给药剂量下，多次给药会使替芬泰Cmax升高，对其暴露量AUC0-∞没有显著影响；会使代谢物M8和M9的血药峰浓度升高，同时暴露量增加。提示若此浓度的药物用于患者，在患者安全耐受的情况下，AUC的提高则可使患者的治疗效果更好[16]。

替芬泰300、600 mg 多次给药后，血浆中替芬泰、代谢物M8和代谢物M9的蓄积系数在两剂量组间数值相当。根据蓄积系数的计算结果，在300、600 mg 剂量下多次给药后，替芬泰未表现出蓄积，其代谢物M8和代谢物M9 亦未表现出明显蓄积。本研究结果显示，健康志愿者多次口服（剂量300、600 mg）替芬泰片后，600 mg 组1例志愿者发生了1次轻度咽喉部不适，有异物感的不良事件，判定为与药物无关，无志愿者因不良事件退出试验。提示多次口服（剂量300、600 mg）替芬泰片在健康人群中安全性较好。

综上所述，替芬泰片600 mg 仍未表现出明显的蓄积作用，且安全性高，为了取得较好的抗病毒效果，可建议每日参考剂量为600 mg。

图1 600 mg 给药剂量下替芬泰片、M8、M9的高效液相色谱图