HPLC 法同时测定龙甘胃舒分散片中5 种成分的含量*

★ 李晶 虞金宝

（江西省中医药研究院 南昌 330046）

龙甘胃舒分散片经由民间传统验方研制而成。处方由龙胆草、大黄、甘草、陈皮、炒香附等组成，具有清热泻火、疏肝理气、和胃止痛的功效，对胃热炽盛证和肝气犯胃证所致的胃脘灼热，疼痛拒按，口干、口苦、泛酸，嘈杂等临床疗效甚佳，此外还可用于幽门螺杆菌阳性的胃病。基于中药具备的多成分、多靶点作用特点，为了进一步规范并监控制剂质量，本文研究了大黄、陈皮和甘草3 味主药的有效成份含量测定，以期更加全面地保证产品质量，确保临床疗效。

现代药理研究表明,龙胆草中主要有效成分龙胆苦苷具有抗炎、解痉以及促进胃液和胆汁分泌的作用［1］；大黄泻下实热主要功效成分大黄素可通过增加小肠胃动素和抑制生长激素抑制素两种途径促进小鼠肠道平滑肌收缩，增强肠道蠕动［2-3］；陈皮中的活性成分橙皮苷和新橙皮苷可通过胃环氧合酶-2（COX-2）和胃DNA 碎片的表达从而改善大鼠（吲哚美辛诱导）的胃溃疡症状［4］；甘草化学成分以黄酮类、三萜类以及多糖类为主，具有抑菌抗炎、抗肿瘤以及调节机体免疫等作用［5-6］。前期研究通过HPLC 法建立了制剂中君药所含龙胆苦苷的含量测定方法［7-8］，但由于检测指标单一，不能全面反映产品质量，同时因龙胆苦苷半缩醛结构具有化学不稳定性。因此，本次实验分别选取更为稳定的大黄酚、大黄素、甘草次酸、甘草苷以及橙皮苷为检测指标进行含量测定方法考察。

1 仪器与试药

1.1 仪器 HP-1260 全自动高效液相色谱仪（美国：安捷伦公司）；Simplicity TM 个人型超纯水系统（Millipore 公司）；CQ-250 超声波清洗器（上海船舶电子设备研究所）；AG-135 电子天平（梅特勒——托利多仪器上海有限公司）。

1.2 材料 大黄酚对照品（批号：171238-200303）、大黄素对照品（批号：171203-200303）、甘草酸铵对照品（批号：171238-200303，甘草酸重量=甘草酸铵重量/1.0207）、甘草苷对照品（批号：171203-200303）、橙皮苷对照品（批号：171238-200303）均购自中国食品药品检定研究院，供含测用；甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。龙甘胃舒分散片（自制，批 号：20171101、20171102、20171103、20180101、20180102、20180103；投料药材购于江西汇仁堂药品连锁有限公司）。

2 方法与结果

2.1 溶液的配制

2.1.1 对照品溶液 分别精密称取大黄酚、大黄素、甘草酸铵、甘草苷和橙皮苷对照品10.62，10.16，10.96，10.41，10.71mg，以甲醇溶解并稀释成质量浓度为每1mL 含大黄酚84.96μg、大黄素121.96μg、甘草酸铵131.52μg、甘草苷208.2μg、橙皮苷428.4μg 的混合对照品储备溶液。精密吸取储备液2mL 于10mL 容量瓶并加甲醇至刻度，摇匀，即得对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液 取本品适量，研匀，取约2.0g，精密称定，置具塞三角瓶中，精密加入甲醇25ml，称定重量，浸泡60min 后加热回流45min，放冷，再次称重，以甲醇补充减失重量，摇匀，滤过，取续滤液适量以微孔滤膜（0.45μm）滤过，作为供试品溶液。

2.1.3 阴性供试品溶液 取龙甘胃舒分散片制剂处方中缺大黄、甘草和陈皮的其它药材按制剂处方比例及工艺制备三味药的阴性制剂，并以其依2.1.2项下供试品溶液方法制得阴性供试品溶液。

2.2 色谱条件的选择 色谱柱：Dikma Platisil ODS柱（4.6mm×250mm，5μm），流动相：甲醇（A）-0.1%磷酸系统（B）梯度洗脱，流动相梯度（0～15min，40%A；15～50min，40%A →90%A；50～60min，90%A；61～70min，40%A），流速：1mL/min，检测波长283nm。在此条件下，供试品溶液色谱图中呈现大黄酚、大黄素、甘草酸铵、甘草苷以及橙皮苷对照品相同保留时间的色谱峰，且与其它相邻色谱峰均能获得分离度大于2.0 的较好分离，同时测定阴性供试品溶液未出现干扰此五种成分的色谱峰，见图1。

图1 阴性供试品溶液-混合对照品溶液-供试品溶液HPLC图

2.3 线性范围 取2.2.1 项下混合对照品储备溶液分别稀释并配制成不同浓度的混合对照品溶液。分别吸取10μL，注入液相色谱仪中，按上述色谱条件测定，将样品浓度与峰面积进行回归，发现大黄酚、大黄素、甘草酸铵、甘草苷以及橙皮苷浓度与峰面积在一定浓度范围内呈良好的线性关系，结果见表1。

表1 对照品回归方程及线性范围（n=2）

2.4 精密度 精密吸取同一混合对照品溶液10μL，按上述色谱条件，重复进样6 次，测定峰面积，计算大黄酚、大黄素、甘草酸铵、甘草苷以及橙皮苷峰面积值的RSD 分别为0.81%、0.72%、0.65%、0.93%和0.88%（n=6）。表明仪器性能稳定。

2.5 稳定性 精密吸取同一供试品溶液10μL，于0，1，2，4，8，12，24h 分别测定峰面积，结果24h 内供试品溶液中大黄酚、大黄素、甘草酸铵、甘草苷以及橙皮苷峰面积的RSD 分别为1.53%，1.62%，1.71%，1.24%，1.87%，表明方法稳定性良好。

2.6 重复性试验 取同一批号制剂6 份，照2.2.2项下供试品溶液制备方法制成供试品溶液，测定并计算大黄酚、大黄素、甘草酸、甘草苷以及橙皮苷含量分别为0.0960，0.1471，0.1208，0.2675，0.6965mg/片，RSD 分别为0.96%，1.57%，0.96%，1.83%，1.61%。

2.7 加样回收率试验 取本品适量，研细，取约1.0g，共6 份，精密称定，分别具塞锥形瓶中，各精密加入每1mL 含0.008552 mg 大黄酚、0.013116mg大黄素、0.012408 mg 甘草酸铵、0.024192 mg 甘草苷以及0.06204 mg 橙皮苷峰的混合对照品溶液25mL，余按2.2.2 项下方法制备供试品溶液，测定并计算回收率，大黄酚、大黄素、甘草酸铵、甘草苷以及橙皮苷平均加样回收率分别为98.93%，98.95%，102.57%，99.67%，103.43%，RSD 分 别为1.85%，1.27%，0.92%，0.89%，1.43%。

2.8 含量测定 按“2.2”项下方法制备供试品溶液，测定6 批不同批次制剂中大黄酚、大黄素、甘草酸铵、甘草苷以及橙皮苷的峰面积并计算含量，每批制剂平行操作2 份。结果见表2。

表2 6批制剂各成分含量（n=2） mg/片

3 讨论

3.1 色谱条件 参考2015 年版《中国药典》中大黄、甘草、陈皮含量测定下色谱条件，实验中分别对流动相和检测波长进行了考察，经对比采用甲醇-0.1%磷酸、乙腈-0.1%磷酸、甲醇-冰醋酸系统为流动相梯度洗脱后各成分的分离效果，发现以甲醇-0.1%磷酸系统为流动相进行梯度洗脱为优；鉴于大黄素、大黄酚检测波长为254nm，甘草酸铵、甘草苷和橙皮苷检测波长分别为250，237，283nm，通过对以上各检测波长予以考察，结合文献分析并比对各对照品的DAD 光谱分析发现，各成分色谱峰在250，254，283nm 处分离效果良好，但以283nm 处各峰整体响应值均较高，且基线平稳，因此最终确定以283nm 作为检测波长最为适宜。此外，还开展了流动相pH 值、流速、柱温以及不同品牌色谱柱等色谱条件耐用性的考察，结果显示文中建立的方法耐用性良好。

3.2 预试验方法考察 供试品的制备方法研究中先后对提取方法（回流、超声以及是否浸泡）、提取溶剂（50%甲醇、甲醇、70%乙醇、乙醇）、浸泡时间（30，60，120min）、提取时间（30，45，60min）以及溶剂用量（25，50，100mL）进行了单因素考察，结果显示以提取1h 为前提，采用甲醇回流提取方法处理的供试品中甘草苷和橙皮苷的提取效果明显优于超声提取方法，对其他三种成分该二种方法的提取效果相当。同时，通过增加浸泡过程亦有助于各成分的提取，而回流提取45min与60min 各成分提取效果无显著性差异，且不因溶剂用量和浸泡时间的增加而改变。

3.3 龙甘胃舒汤方 用于中医证型的胃热炽盛证和肝气犯胃证所致的胃脘灼热，疼痛拒按，口干、口苦等症已近三十年，前期的临床及药理研究表明，其对于幽门螺杆菌（Hp）检查阳性胃病的临床治疗取得良好效果，为进一步明晰其作用途径，下一步我们将开展其抗Hp 作用机制研究，同时对影响其药效的相应化学成分进行进一步筛查并构建其基于抗Hp 作用的质量评价方法，为临床Hp患者的治疗用药提供参考。