脂多糖致大鼠发热特点与机制研究进展＊

杨 彪 ，胡玉梅 ，刘文君 ，姜 涛 ，耿 婷 ，曹 亮 ，王振中 ，肖 伟 ＊＊

（1. 江苏康缘药业股份有限公司 连云港 222001；2. 中药制药过程新技术国家重点实验室 连云港 222001）

发热是一种机体面对病原体入侵时产生的一种复杂的防御性反应，是生物历经几百万年进化而来的一种生存策略[1-2]。机体每升高1℃需增强10%～12.5%的代谢速度[3]，因此发热通常伴随一系列的“疾病行为”，如体温升高、虚弱、疲倦等，而这些行为是为让机体更快地恢复健康[4]。所以，发热是一种生理反应，而不是病理反应。脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）是革兰阴性菌外壁的类脂质多糖，其可通过与细胞表面Toll样受体4（TLR-4）结合引发炎症因子的大量表达，导致炎症相关症状如红、肿、热、痛等，故常被用于诱导炎症动物模型及细胞模型的建立[5]。自Szekely 以来，LPS 致大鼠发热模型被广范运用到发热机制研究中，但由于多方面因素的影响，研究者得到的结果有所不同。因此，本文对LPS 引发大鼠发热的特点与机制展开论述，为广大实验人员在建立大鼠发热模型及解热作用研究等方面提供一些帮助。

1 LPS致大鼠发热的特点及影响因素

1.1 特点

LPS 致大鼠发热的时间-体温曲线会随LPS 剂量、外界环境温度的变化呈单相、双相乃至多相变化，每一相也被称为发热的不同阶段[6]。通常LPS 致发热的产生可分为两个阶段。一是发热的起始阶段，也称第一阶段，此阶段具有发热迅速、持续时间较短等特点。二为发热的持续阶段，这个阶段包括除发热起始阶段之外后续的发热过程，通常包括第二及第三阶段，具有持续时间长、多相变化等特点。此外，两个阶段有着截然不同的机制。

1.2 影响因素

1.2.1 LPS的剂量

LPS 剂量对大鼠发热过程中的体温调节有着重要作用[7]。在外界环境温度适中的情况下，LPS 浓度在 100～101μg·kg-1时引起单相体温升高，LPS 浓度在101.5μg·kg-1时，体温呈现双相波动，当 LPS 浓度达到101.75～104μg·kg-1时，发热呈现出三相波动，且随 LPS浓度的升高，发热持续时间延长、幅度增大[8]。

在一定剂量范围内LPS 致热作用呈现剂量依赖性，但超出一定范围后增加剂量并无作用[9]。剂量范围跨度大：腹腔或静脉注射10-1 000 μg/kg 不等，视模型需要做预实验调整剂量[10]。通常注射剂量范围20-250 μg/kg，引发双相热或三相热，降低剂量呈单相热，反复注射会致耐受[11]。内毒素缓释，例：LPS 胶原水凝胶注射可克服反复注射LPS导致的耐受，形成SD大鼠从高热到持续低热[12]。常见造模剂量有三个：20 μg/kg、80 μg/kg、100 μg/kg，80 μg/kg剂量出现最多。20 μg/kg引发双相热，80 μg/kg、100 μg/kg引发三相热。动物品系、生理状态以及实验室环境等均的会影响峰值出现时间、最大峰值，80 μg/kg 和 100 μg/kg LPS 致发热比20 μg/kg致发热模型发热的热势高，发热时间长，利于观察以及进一步其他实验操作，例如给药观察等。常见剂量20 μg/kg、80 μg/kg、100 μg/kg LPS 致大鼠发热模型体温变化趋势见表1[13-23]。

表1 常见剂量LPS致大鼠发热模型体温变化趋势表

1.2.2 环境温度

环境温度对LPS诱导产生的发热过程有着重要的影响，尤其是对体型较小的物种，如大鼠，很小温度的差别均能产生重大影响，甚至可使体温降低变成发热。而且，不同温度环境下，LPS致大鼠发热过程有着明显的区别。在29-31℃环境中，静脉注射LPS 引起明显的发热，在低浓度时，LPS引起一个单相的体温升高，当剂量升高后，LPS 引起几个连续的体温升高过程。而在一个温度较低的环境中（26℃），同样低浓度的LPS 引起双相的发热，随着LPS 浓度的升高会导致低体温现象出现[24]。

1.2.3 注射方法

通常实验者采用腹腔或静脉注射LPS 进行造模，而这种方法会让大鼠产生严重的紧张和疼痛感，这种情况会造成大鼠的体温波动1-3℃，并且持续30-120 min，对后续的体温监测产生严重影响，并使正常的发热起始阶段被掩盖或使单相发热被认为是双相发热，具有严重的欺骗性。而且不同的给药方法也会对发热产生的时间有较大影响[25]。

1.2.4 其他

除上述三个主要因素之外，还有一些因素可能会造成影响，如大鼠的性别、品系、造模前禁食禁水与否、实验者注射手法熟练程度等。其中，雌性大鼠的荷尔蒙水平会直接影响发热反应。

2 发热的不同阶段及机制

2.1 发热的起始阶段

早期发热理论认为发热的起始阶段是由内致热源经血液循环通过血脑屏障作用于大脑发挥作用[26]，后经实验[27]证实，内致热源如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等在LPS 注射后的30-60 min 才出现在血液循环中，而此时发热已产生。随后补体系统的发现以及迷走神经传输理论成为发热起始阶段的关键因素，并受到广范认可。通常发热的起始阶段发生在LPS注射后15 min，并在1 h 左右达到峰值[28]。起始阶段的潜伏期会随着LPS剂量的增加而有所缩短，幅度也会有所增加。

2.1.1 起始阶段的关键因素

2.1.1.1 Kupffer细胞（Kc）

Kc 是机体内最大的巨噬细胞群，存在于肝脏中，担任着LPS 代谢清除的任务。同时，它也是TLR-4 的主要供体细胞以及补体因子5a（C5a）的作用细胞，在发热的启动过程和终止过程中起到重要的作用。L 等[29]采用异硫氰酸荧光素（FITC）标记LPS，观察到发热起始阶段的体温升高与Kc 摄取FITC 标记的LPS 密切相关。

2.1.1.2 补体系统的激活

补体系统是自身免疫系统的一个重要组成部分，它可被病原体及其代谢产物迅速激活[30]。静脉注射LPS 可在2 min内引起补体的级联反应，引起各种细胞因子的生成，且大多数炎症因子白细胞介素-1（IL-1）、IL-6、前列腺素 E2（PGE2）和 TNF-α 等与发热密切相关[31]。补体系统的激活过程主要发生在Kc 细胞中，如图1 所示。补体C 代谢生成补体C3，补体C3进一步代谢生成C5a，C5a通过与补体因子5a受体（C5aR）结合启动磷脂酶C（PLC）水解生成花生四烯酸（AA），接着AA在环氧酶-1/2（COX-1/2）的作用下生成PGE2和前列腺素D2（PGD2）等[32]。Li等[33]通过基因敲除及C5aR受体拮抗剂证实了C5a在发热的起始过程中起到重要作用。

2.1.1.3 肝脏传入迷走神经与去甲肾上腺素（NE）

肝脏传入迷走神经元表面表达有前列腺素EP3受体[34]，可与C5a诱导产生的PGE2结合，通过迷走神经将信号向下丘脑前区（POA）传送。Simons 等[35]研究发现肝脏迷走神经切断术可阻断发热产生及PGE2升高，证实了肝脏迷走神经在发热起始过程中有着重要的作用。Kc-PGE2信号传入POA 后会刺激NE 的释放，引起棕色脂肪代谢及皮肤收缩，导致发热。同时生成的NE 会刺激PGE2的生成，值得注意的是此处生成的PGE2是由神经胶质、神经元本身及树突小棘产生[36-37]。

图1 发热起始阶段信号传导通路图

2.1.1.4 激活内源性Kalikrein-kinin系统

研究[38]发现 LPS 激活内源性 Kalikrein-kinin 系统导致Bradykinin(BK)产生，其作用于POA 细胞的B2 受体导致前列腺素合成，进而产生发热。

2.1.1.5 信号传导过程

如图1 所示，LPS 进入机体后随血液循环至肝脏（Liver）中，通过激活补体系统产生PGE2，产生的PGE2通过与肝脏传入迷走神经元（Hepatic vagus neuron）的EP3受体结合将信号传入到非颤栗产热（NST）细胞群A1和A2后，再通过腹侧的NE能神经束进一步传递到POA，引起NE的释放，NE通过与温敏神经元上的肾上腺素受体α1（α1-AR）结合，引起棕色脂肪代谢及皮肤收缩，产生快速发热。

2.2 发热的持续阶段

关于发热持续阶段的机制有过不同的理论，目前最被学者认可的是血脑屏障（BBB）在发热的持续中产生重要的作用[39]。研究[40]发现BBB 周围的星形胶质细胞、内皮细胞、巨噬细胞等均含有TLR-4 受体，而且大脑内皮细胞表达有TNF-α、IL-1、IL-6 受体。这些均表明BBB 不是信号传导的障碍而是信号的产生者，在发热的持续阶段具有重要的地位。

2.2.1 持续阶段涉及的关键因素

2.2.1.1 LPS的识别—TLR-4的激活

大多数病原体有着高度相似的组成结构，被称为“病原体相关分子模式”，而这些结构会通过TLRs 家族激活机体的自身免疫系统。其中，TLR-4 是LPS 的同源受体，常在表达于巨噬细胞、中性粒细胞及树突状细胞表面。LPS与LPS连接血清蛋白（LPB）结合后，在CD14分子作用下与由MD2 分子作用激活的TLR-4结合，过程中还涉及到MyD88、IRAK和TRAP6等因子，最终激活核转录因子-κB（NF-κB），生成多种炎症因子（TNF-α、IL-1、IL-6等）、黏附因子以及一些炎症相关的酶[一氧化氮合成酶（iNOS）、环氧酶-2（COX-2）、前列腺素合成酶（mPGES-1）等][41-43]。研究[44-45]采用基因敲除技术发现TLR-4基因敲除C3H/HeJ大鼠不能对LPS刺激产生发热反应，证实了TLR-4 在发热中的重要作用。

2.2.1.2 内致热源的产生

内致热源最初由Beeson[46]提出，主要是指由外致热源，如LPS，诱导下由机体自身产生的，促使发热的因子，多是炎症因子。在发热过程中，无论是LPS 与TLR-4 结合激活NF-κB，还是补体系统，都可导致炎症因子（TNF-α、IL-1、IL-6 等）的产生。研究[47-49]发现，静脉注射 LPS 后30-60 min，TNF-α，IL-1，IL-6 相继在血液中出现。而且，TNF-α与IL-1可相互促进彼此的生成，两者都可促进IL-6 生成，而IL-6 能抑制TNF-α 与 IL-1 生成。TNF-α、IL-1、IL-6 主要在发热的维持阶段起到作用，与发热的起始阶段无关。其中，IL-6对机体免疫功能有促进作用。

2.2.1.3 PGE2的生成与传导

PGE2是公认的发热介质之一[43]。PGE2与下丘脑部位的EP3受体结合是维持发热的重要过程。其代谢过程主要由细胞膜磷脂在磷脂酶A2 作用下水解生成的 AA 经 COX 及 mPGES 代谢生成。在 LPS 诱导的发热过程中，COX-2 和mPGES-1 不仅在大脑部位的巨噬细胞中大量表达，而在肝脏和肺部的巨噬细胞中也大量表达[50]。采用抑制前列腺素（PG）合成的药物以及COX-2或mPGES-1缺陷小鼠均可抑制发热产生[51]。同时，在发热的持续阶段，肝脏部位的PGE2代谢酶表达量降低，促进了PGE2向大脑的转移[52]。

2.2.1.4 EP3受体

EP3受体在下丘脑视前区大量表达[53]。PGE2受体与EP3在脑部结合是发热产生的必要条件之一[54]。Michael 等[55]研究表明PGE2与处于内侧视前核的神经元表达的EP3受体结合是发热产生的关键因素。

2.3 信号传导过程

发热持续阶段的PGE2可分为两部分，一部分由外周生成转移至大脑，另一部分由大脑部位自身生成。两部分的产热机制基本相同，都是通过LPS 直接或间接作用而产生。过程如图2 所示。血液循环中的LPS通过与外周巨噬细胞、中性粒细胞等表面的TLR-4 受体结合并激活NF-κB 产生各种炎症因子TNF-α、IL-1、IL-6 等，生成的炎症因子可通过 PLA2-AA-PGE2产生PGE2。同时，炎症因子及LPS 可直接与大脑内皮细胞表面受体（TLR-4R、IL-1R、IL-6R）结合，产生PGE2，机制与外周相同。外周生成的PGE2通过BBB进入中枢，同BBB 处生成的PGE2共同与神经元的EP3受体结合，生成NE，继而引起棕色脂肪代谢增加，血管收缩等反应，引起发热。

3 小结

LPS致大鼠发热模型现已广泛应用于各种解热实验中，充分了解LPS 致大鼠发热的特点与机制对实验者有着重要的帮助。本文对LPS致大鼠发热过程中的影响因素进行了总结，主要包括LPS的剂量、环境温度以及注射的方法，把控好这些因素会对模型的建立以及实验的可靠性提供一定的帮助。在模型建立的过程中，可根据实验目的给予 LPS 剂量在 101.75～104μg·kg-1范围内维持发热的稳定性。可通过控制通风、空调等条件严格控制实验环境的温度在25℃左右，一定不能高于体温。同时，在给药及测量体温的过程中，实验操作者对大鼠的抓取要经过练习，最好是使大鼠习惯操作者的抓取动作，避免因抓取使大鼠产生挣扎导致体温的变化。最后，条件较好的情况下可采用皮下植入体温测定装置，以计算机实时监控大鼠的体温变化，这里需要注意，手术植入体温测定后需要对大鼠进行至少一周的消炎处理，避免其发生炎症反应。

在了解发热特点的基础上，本文对LPS 致大鼠发热的机制进行了初步总结。发热可分为两个阶段，一是起始阶段，二是持续阶段。两个阶段有着不同的特点并有着不同的机制。在发热的起始阶段，LPS 通过肝脏Kc 中的补体系统快速生成PGE2，PGE2激活肝脏迷走神经传入神经元、NST，最终将信号传入POA，生成NE，引起发热。在发热的持续阶段中，LPS 通过与TLR-4 受体结合激活NF-κB 产生各种炎症因子TNF-α、IL-1、IL-6 等，这些炎症因子以及 LPS 通过与大脑部位的细胞，包括内皮细胞、星形胶质细胞等部位的受体结合，激活细胞内COX-2 生成PGE2，PGE2通过与神经元EP3 受体结合，传导信号至POA，引发NE 释放，进而导致发热。虽然研究将发热分为两个阶段，并在时间上存在先后关系，但两个阶段并非相互独立，两者也是同时进行并相互影响的。

图2 发热持续阶段信号传导通路图

目前对发热的机制研究已较为明确，但仍然存在一些疑问，比如低温环境中高剂量LPS 导致低体温现象的机制是什么？替代激活的脂肪中巨噬细胞在LPS致发热中有什么作用？这些问题仍需科研人员进一步研究解答。本文对LPS致大鼠发热机制进行了一定的总结，希望对科研人员在建立LPS 致大鼠发热模型中所遇到的问题有所帮助。