基于网络药理学的乳香-没药药对药效机制研究＊

周 宜，邓蓝冰，周游宇，孟祥龙

（1. 湖南中医药大学第二附属医院 长沙 410005；2. 山西中医药大学中药与食品工程学院 晋中 030619）

乳香、没药配伍应用最早出现在《证治准绳》中的“乳香止痛散”[1]中。乳香性味辛、苦、温，功效活血定痛，消肿生肌，侧重行气活血；没药性味辛、苦、平，功效散瘀定痛，消肿生肌，侧重活血化瘀。两者在临床上经常相须为用，协同增效，为治疗脏腑、经络不通之要药，对改善风湿痹痛、经闭痛经、跌打损伤瘀痛等疼痛具有较好的疗效[2]。乳香、没药作为活血化瘀类常用中药，二者经常以药对形式出现在临床上，仅《中国人民共和国药典》（1995 年版）和卫生部颁发的中药成方制剂标准中收载含乳香、没药的中成药就有161个，因此临床应用非常广泛。

网络药理学是在系统生物学的理论指导下，对生物系统进行网络分析的学科，是一个通过对多靶点药物分子的分析，选取特定信号节点的过程。这个过程是通过多学科的技术和内容进行融合来完成的,包括系统生物学、多向药理学、生物信息学和计算机科学等学科，从而进行“药物-靶点-疾病”等多层次网络的构建，药物与疾病相关性研究，也可以阐明药物作用机理，从而指导新药的开发。因此，从上可知，网络药理学的研究视角和研究方法具有一定的整体性、系统性及复杂性，这几个特点正好与中医药整体观与辨证论治的原则不谋而合。乳香-没药药对很早就出现在临床应用中，一方面在治疗疼痛方面疗效显著，另一方面随着其不良反应报道的逐渐增多，药理毒理方面的研究也取得了一些进展[3]。比如在临床治疗中，使用乳香-没药药对治疗后会刺激患者的皮肤，使得患者皮肤过敏或者会出现胃肠道反应，出现恶心呕吐、食欲不振等[4]。本研究利用网络药理学研究方法构建乳香-没药药对的“药物-靶点-疾病”网络，对乳香-没药药对治疗抗溃疡、抗炎[5]、抗肿瘤[6]、炎症性肠病和镇痛五种疾病的作用机制进行分析找出共性和高频率的主要化合物、基因、靶点以及细胞通路解决或减少药物的不良反应,为研究其作用机理和临床应用奠定基础。

1 方法

1.1 乳香、没药成分收集

通过中药系统药理学数据库和分析平台（http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php，TCMSP）[7]，以“乳香”、“没药”为关键词检索出乳香、没药中的化学成分。

1.2 活性化合物和靶标蛋白的筛选

目前对乳香-没药药对和靶点的筛选无相关文献及报道，本研究旨在对乳香-没药药对全化合物进行活性化合物筛选，从而构建“药物-疾病-靶点”网络，以此探究乳香-没药药对的药效机制所以不以生物利用度（OB）和类药性（DL）进行筛选活性化合物。

1.3 疾病靶点的筛选

通过在线人类孟德尔遗传数据库（http://www.omim.org/,OMIM，）[8]，人类基因数据库（GeneCards，https://www. genecards. org/）[9]，分 别 以“ 抗 炎/Antiinflammatory”，“ 镇 痛/Analgesia”，“ 抗 肿 瘤/Antitumor”，“ 抗 溃 疡/Anti-ulcer”，“ 炎 症 性 肠 病/Inflammatory bowel disease”为关键词检索与抗抗溃疡、抗炎、抗肿瘤、炎症性肠病和镇痛相关的基因。

1.4 韦恩图的构建

分别将药物和疾病靶点上传至在线韦恩图（http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）, 在线得到活性化合物与抗溃疡、抗炎、抗肿瘤、炎症性肠病和镇痛五种疾病的交集基因。

1.5 靶标蛋白基因名的确定及化合物-靶点网络的构建

查询靶标蛋白对应的基因名用到以下公开的免费数据库，分别是全球蛋白资源数据库（UniProt，https://www.uniprot.org/）[10]、医学文献检索服务系统（Pub Med，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed）[11]，人类基因组数据库（HGNC，https://www.genenames.org/）等，并用Cytoscape 3.7.1(http://cytoscape.org/)软件构建化合物-靶点网络，分析化合物和靶点间的度（degree）值。

1.6 蛋白质相互作用网络（PPI）的构建

借助蛋白质相互作用关系数据库（STRING 11.0，https://string-db.org），将乳香-没药对与五种疾病的交集基因分别上传至STRING 数据库，在线获取乳香-没药药对与五种疾病的蛋白相互作用网络。

1.7 核心靶点的通路分析

分别将乳香-没药药对治疗抗溃疡、抗炎、抗肿瘤、炎症性肠病和镇痛的蛋白靶点上传至生物学信息注释数据库（DAVID，https://david.ncifcrf.gov/home.jsp），在线进行基因本体（GO）生物学过程富集分析和基于京都基因与基因组百科全书（KEGG）代谢通路富集分析,并借助Cytoscape 3.7.1（http://www.cytoscape.org/）软件绘图，使其结果可视化。

2 结果

2.1 药物靶点和疾病靶点数据的筛选

以1.2 项下相关条件进行检索，共筛选出乳香、没药中403 个化学成分和1949 个靶点蛋白；其中乳香化学成分占127 个，蛋白靶点占659 个。鉴于文章篇幅，故其活性化合物基本信息见附表1。

2.2 乳香-没药药对与五种疾病的交集基因

按1.3项下，分别按照相关检索条件将每种疾病的OMIM 数据库与GeneCards 数据库的在线检索结果合并，得出五种疾病的相关基因靶点。通过数据库找出乳香-没药药对活性化合物247个活性靶点，抗溃疡4245个相关基因，抗炎873个相关基因，抗肿瘤1963个相关基因，炎症性肠病4588个相关基因，镇痛996个相关基因。

按1.4 项下，分别将药物和疾病靶点上传至在线韦恩图得出乳香-没药与抗溃疡相关基因交集基因有181 个，与抗炎相关基因交集基因有120 个，与抗肿瘤相关基因交集基因有140 个，与炎症性肠病相关基因交集基因有184 个，与镇痛相关基因共有142 个，见图1。乳香-没药药对与五种基本高频基因共有79 个见表1。乳香-没药与五种疾病交集基因列表见附表2。

2.3 “药物-靶点-疾病”交互网络的构建

按1.5 项下相关操作，基于Cytoscape 3.7.1（http://www.cytoscape.org/）软件构了建乳香-没药药对与五种疾病的“药物-靶点-疾病”交互网络，见图2。根据乳香-没药药对与五种疾病的“药物-靶点-疾病”交互网络，总结出化合物所属的类别，见图3。

图1 乳香-没药药对与五种疾病的韦恩（Venn）图

表1 乳香-没药药对与五种疾病高频基因

乳香-没药药对针对上述五种疾病治疗的药效部位为挥发油类成分，如L-乙酸冰片酯（LBornyl acetate）、L-香芹酮（L-carvone）、β-波本烯（β-Bourbonene）、β-榄香烯（β-elemene）、大豆苷元（Daidzein）和桃金娘醛（myrtenal）等，在抗溃疡、抗炎、抗肿瘤、炎症性肠病和镇痛五种疾病中挥发油类成分分别占87.50%、81.21%、80.00%、86.45%、78.65%，就此推知，挥发油类为乳香-没药药对治疗五种疾病的高频化合物种类；另外高频共性树脂类成分主要有丁酸芳樟酯（linalyl butyrate）、α-古芸香烯（α-gurjunene）、卡巴雌二醇（cabraleadiol）和 O-乙酰基-β-乳香脂酸（O-acetyl-β-boswellic acid）等。

2.4 乳香-没药药对与五种疾病的蛋白相互作用核心网络（PPI）的构建

按1.6 项下相关操作，借助蛋白质相互作用关系数据库（STRING 11.0，https://string-db.org），分别构建出乳香-没药与五种疾病的相互作用核心网络图（PPI），见图 4，5 种疾病的 PPI 网络图分析，见附表3，乳香-没药药对与五种疾病的高频共性靶点，见表2。

乳香-没药药对与五种疾病的PPI 网络图中心点均为蛋白激酶B1（AKT1），此外，频率较高的蛋白还有白细胞介素6（IL-6）、血管内皮生长因子A（VEGFA）、前列素内环氧化物合成酶2（PTGS2）、丝裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）等。

经对比分析，共得到20个高频共性靶点，其中，蛋白激酶B1（AKT1）通路是膜受体信号向细胞内转导的主要信号通路，能对凋亡相关的蛋白进行调节，以维持细胞存活及增殖和抑制细胞凋亡[12]。蛋白激酶B（protein kinases B，PKB）作为信号转导通路的重要调节因子，主要通过而磷脂酰肌醇3 激酶（phosphatidyl inositol 3kinase，PI3K）/蛋白激酶B（PI3K/PKB）是丝氨酸/苏氨酸（Ser/ Thr）蛋白激酶家族的主要成员之一，其主要作用是调节信号途径调节细胞代谢、细胞周期，促进细胞生长和增殖并抑制细胞凋亡的作用[13]并且能将细胞外刺激信号传递到细胞核，在周围缺血半暗带（ischemic penumbra，IP）区损伤级联反应中发挥重要作用[14]。血管内皮生长因子A（VEGFA）是一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，特别是在平衡新血管的形成并使血管通透性增加以及现有血管的维持和重塑方面起重要作用[15]。白细胞介素6（IL-6）是一种多效性的促炎细胞因子，可在多种自身免疫性疾病的病理过程中起重要作用[16]。

表2 乳香-没药药对与五种疾病高频靶点度值

图3 乳香-没药药对治疗五种疾病的药效化合物归类

2.5 基因本体（GO）功能富集分析

按1.7 项下，分别将乳香-没药药对治疗抗炎、镇痛、抗肿瘤、抗溃疡和炎症性肠病的蛋白靶点上传至DAVID 数据库，在线得到五种疾病的GO 条目数其中抗溃疡获得166 条富集结果，抗炎症获得150 条富集结果，抗肿瘤获得134 条富集结果，炎症性肠病获得157条富集结果，镇痛疾病获得157条结果。其可视化结果见图5。得到8个高频共性条目，分别为受体配体活性（receptor ligand activity）、辅因子结合（cofactor binding）、细 胞 因 子 受 体 结 合（cytokine receptor binding）、细胞因子活性（cytokine activity）、四吡咯结合（tetrapyrrole binding）、血红素结合（heme binding）、泛素样蛋白连接酶结合（ubiquitin-like protein ligase binding）、DNA 结合转录激活剂活性（DNA-binding transcription activator activity）。其中血红素结合（heme binding）是在线粒体及胞质中协作完成，由此需要胞质线粒体的物质跨膜运输，血红素合成起始需要将胞质中的甘氨酸及δ-氨基酮戊酸合成酶2（δaminolevulinatesynthase 2,ALAS2）运送进线粒体内，而合成产物δ-氨基酮戊酸（δ-aminolevulinate,ALA）需要被运送出线粒体进入细胞质[17]。泛素样蛋白连接酶（ubiquitin-like protein ligase binding）属于环指结构域蛋白家族[18]，它能够特异性识别并结合目标蛋白，主要包括 HECT 结构域（homologous to E6-APCterminus,HECT）、环指结构域和U 形箱式结构域（U-box）蛋白三大家族；细胞因子可以分为淋巴因子（lymphokine）、单核因子（monokine）、非淋巴细胞（Non-lymphocyte），其中淋巴因子中IL-6的生物学功能具有多样性，在机体的免疫调节、造血调控、炎症反应等过程中均发挥着重要的作用所以细胞因子活性（cytokine activity）与炎症[19]相关。

2.6 基于京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析

图4 乳香-没药药对与五种疾病的相互作用核心网络图（PPI）及高频节点分析

按1.7 项下，分别将乳香-没药药对治疗抗炎、镇痛、抗肿瘤、抗溃疡和炎症性肠病的蛋白靶点上传至DAVID 数据库，在线得到五种疾病的KEGG 通路数其中抗溃疡、抗炎、抗肿瘤、炎症性肠病、镇痛分别筛选到 158 条、148 条、148 条、153 条、151 条信号通路。其可视化结果见图6。共得到6条高频共性KEGG 通路，分别为卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染（Kaposi′s sarcoma-associated herpes virus infection）、乙型肝炎（Hepatitis B）、人 巨 细 胞 病 毒 感 染（Human cytomegalovirus infection）、糖尿病并发症的AGERAGE 信 号 通 路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、PI3K-AKT 信号通路（PI3KAkt signaling pathway）、流体剪切应力与动脉粥样硬化（Fluid shear stress and atherosclerosis）。卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染（Kaposi′s sarcoma-associated herpes virus infection）包括病毒原发感染和病毒裂解期蛋白，它能够诱导多种细胞因子的表达与分泌，如促血管生成因子和炎症因子，并且促进病灶的血管生成、炎症浸润和肿瘤播散[20]。PI3K-AKT 信号通路（PI3K-Akt signaling pathway）过度表达和活化与肿瘤的进展密切相关。上游分子通过与PI3K 结合，使其构象发生改变，从而磷酸化激活Akt，Akt 的活化能调控其下游分子，参与肿瘤调控通路[21]。

图5 乳香-没药药对与五种疾病的基因本体（GO）功能富集分析

3 讨论

到目前为止，有关乳香-没药药对的化学成分和药理作用研究较多，且研究比较深入透彻。乳香为橄榄科植物卡氏乳香树（Boswellia carterii Birdw）。乳香最早记载于《明医别录》，其被列为上品，性味辛、苦，温，入心、肝、脾经[22]。现代研究表明乳香中的主要化学成分包括挥发油（3%-8%）、树脂（60%-70%）、树胶（27%-35%）以及少量的杂质[23]。没药（Com-miphore myrrha Engl）最早记载于宋代的《开宝本草》，来源于橄榄科植物地丁树Commiphora myrrha Engl.或哈地丁树Commiphora molmol Engl.的干燥树脂。具有悠久的药用历史，为常用活血化瘀类中药[24]，没药性味辛、苦，平，归心、肝、脾经，具有特异的香气，善于活血止痛，消肿生肌。现代的药理学研究表明，没药的主要化学成分为树脂、树胶和挥发油等，且主要化学成分包括挥发油（2.5%-9.0%）、树脂（25%-35%）、树胶（57%-65%），水分及其它杂质约为（3%-4%）[25]，具有抗炎、降血脂、镇痛、保护肝脏等多种药理作用。现代药理学研究证明两者均具有镇痛、抑菌、抗胃溃疡、抗氧化、降血脂抗炎、活血化瘀抗肿瘤等作用[26]。因此，乳香、没药的临床配伍应用从中医理论可以理解为药物相互作用中的同气相求，两者的配伍药效作用协同增效。

图6 乳香-没药药对与五种疾病的基于京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析

基于网路药理学特点与中医整体观和辨证论治的不谋而合，网络药理学方法在中药潜在活性成分和作用靶点的预测及中药作用机制的阐述的研究中已有广泛的应用[27]。本研究利用网络药理学方法，从整体角度体现出了乳香-没药药对多成分、多靶标和多途径的治疗机制。

乳香与没药生品研末外用，能起到敛疮生肌的作用，可以用来治疗皮肤软组织疮疡溃后久不愈的症状。由于生乳香、生没药具有气味辛烈的特点，对胃肠道有较强的刺激性，容易引起呕吐，故二者在临床上普遍以炮制品内服出现，能够行气、活血、止痛。二者生品经醋制后刺激性大大减弱，便于内服，且能够增强活血止痛收敛生肌的功效[28]。 目前就二者药效及刺激性部位尚存争议，学者对二者炮制过程的内在质控化学部位莫衷一是，基于本研究推知挥发油类为乳香-没药药对治疗疾病的高频化合物种类，在二者炮制加工过程中应考虑挥发油类成分的量变及质变。其中L-乙酸冰片酯（L-Bornyl acetate）具有止泻、止痛、抑制家兔离体肠运动、镇痛、抗炎等作用[29]；β-榄香烯（β- elemene）能够显著抑制人结肠癌细胞（SW480）增殖，引起细胞周期阻滞，诱导细胞凋亡，并抑制肿瘤细胞集落形成[30]。大豆苷元（Daidzein）是大豆异黄酮中的一类，目前的研究发现大豆异黄酮具有诱导癌细胞凋亡、抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭以及抗肿瘤血管生成等作用[31]。 L-香芹酮（L- carvone）是一种从薄荷类物质中提取出来的精油，属于单萜类的天然产物，并广泛应用在食品工业和化学工业中的一种重要的香料。同时，以香芹酮为原料，还可以合成一些具有较好的抗癌、杀菌活性的香芹酮衍生物[32]。

本研究基于网络药理学方法，建立了“药物-靶点-疾病”网络、蛋白互作关系（PPI）网络、基因本体（GO）功能富集分析以及基于京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集的分析，并由此得出乳香-没药药对与抗溃疡、抗炎、抗肿瘤、镇痛和炎症性肠病五种疾病的20 个高频共性靶点，GO 高频共性条目8 个，6条KEGG 高频共性通路，综合以上数据发现乳香-没药中的挥发油类成分是治疗上述五种疾病的主要化学成分。

4 结论

本研究利用网络药理学方法探究乳香-没药药对在抗溃疡、抗炎、抗肿瘤、炎症性肠病和镇痛这五种疾病治疗过程中的共性作用机制以及高频共性靶点、高频共性基因、高频共性KEGG 通路等，为其深入的活性成分研究和及临床应用提供理论支撑和科学依据。