miR-146a、miR-25和CysC在妊娠期高血压合并肾功能损害中的诊断价值

刘琴 彭珊珊

妊娠期高血压疾病是妊娠期特有的疾病，是妊娠与血压升高并存的一组疾病，常对肾脏、心脏、肝脏和脑造成损害，其中首先受到损伤的脏器为肾脏，往往导致母婴的严重后果[1]。早期评价妊娠期高血压疾病合并肾功能损害，早期采取治疗措施，是降低母婴风险的关键[2]。有研究证实妊娠期高血压疾病发生与多种基因存在密切联系，并且有遗传背景的孕妇发生率更高[3]。有研究认为微小RNA(miRNA)是参与了高血压肾病的发生发展过程[4，5]，miR-146a和miR-25研究组证实参与了动脉粥样硬化和高血压肾病的病理生理过程[6，7]，而是否参与了妊娠高血压疾病患者的肾脏损害笔者尚未见报道。血清胱抑素(CysC)已经被证实较为准确评估肾小球滤过率，是评价肾脏功能损害的传统指标[8]。本研究通过联合检测血清miR-146a、miR-25和CysC观察在检测妊娠高血压疾病患者诊断肾功能损害中的临床意义，结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2015年1月至2018年12月在上海中医药大学附属第七人民医院就诊的妊娠高血压疾病患者76例，为妊娠期高血压疾病组，均符合妊娠期高血压的诊断标准。年龄20～39岁，平均年龄(25.38±2.86)岁；孕周22～37岁，平均孕周(35.68±2.31)周；孕次0～3次，平均孕次(2.35±0.65)次；体重50～73 kg,平均(56.68±3.46)kg；其中经产妇16例，初产妇60例，根据疾病的严重程度分为：轻度41例，中度22例，重度13例。选择同期行健康体检者孕妇45例，为正常妊娠组，年龄20～39岁，平均年龄(26.14±1.68)岁；孕周22～37周，平均(35.09±1.68)周，孕次0～3次，平均孕次(2.19±0.62)次；体重51～75 kg,平均(56.97±2.37)kg；其中经产妇10例，初产妇35例。选择同期在体检中心健康体检者30例，为健康对照组，年龄24～42岁，平均年龄(26.38±2.18)岁；体重54～73 kg，平均(56.86±3.76)kg。3组年龄和体重等一般资料差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准：所有患者知情同意，均签署知情同意书，并经医院伦理委员会通过。

1.2.2 排除标准：原发性高血压；妊娠合并感染性疾病；胎儿异常；合并心、肝、肾和肺等重要障碍功能不全；代谢性，免疫性和肿瘤性疾病；有出血和血栓性疾病。

1.3 方法

1.3.1 血液标本采集：患者入院后清晨空腹肘静脉血约10 ml，4℃的条件下放置30 min，低速离心20 min，离心速度1 800 r/min，离心半径15 cm，离心后去上清液，将其保存在-70℃冰箱中保存。

1.3.2 miRNA提取和逆转录反应：根据miRNeasy提取试剂盒的说明书提取miRNA，并通过紫外分光度将吸光度的比值在1.8～2.0的标本保存用于后续检测，保存在-70℃的冰箱中。按照miRNA反转录试剂盒的使用说明书将miRNA反转录为cDNA，标本保存在-70℃的冰箱中。

1.3.3 qRT-PCR检测：根据GenBank中的miR-146a、miR-25和U6的序列号，并用Premier Primer 5.0软件进行引物设计，并由苏州金唯智生物科技有限公司合成引物。miR-146a引物序列，上游：CACGGACCTGAAGAACACTGG，下游：AGAAATGAAATTAGAACACACATCAATTCC，miR-25的引物序列，上游：CGGCGGCATTGCACTTGGTCTC和U6引物序列，上游：ATCCGCAAAGACCTGT，下游：GGGTGTAACACTXAAG。qRT-PCR的总反应体系为25 L，包括上下游引物各1.0 L(其浓度为10 mmol/L)，cDNA为0.8 L，RNaseH2O为12.2 L和SYBRPPrimix Ex TaqTM 10 ml。反应条件为：预变性温度95℃10 min，95℃和60℃分别为5 s和60 s，总共进行40个循环。在60℃下用ABI7700软件收集荧光信号进行溶解曲线分析，每个样品进行3个平行复孔，相对表达量采用表示2-ΔΔCt，公式表达为ΔΔCt=试验组(Ct目标基因-CtU6)-对照组(Ct目标基因-CtU6)。

1.3.4 血清CysC水平检测：采用酶联免疫反应方法对血清CysC水平进行检测，采用武汉明德生物科技股份有限公司生产的试剂盒，按照使用说明书进行检测，具体步骤：取血清100 μl加入到不同浓度的标准品分别放入反应孔中，用胶纸密封后，在37℃的条件下进行温浴，90 min后，用洗涤液洗涤3次，每次5 min。用滤纸干燥反应板。除空白对照组外，其他均加入生物素抗体混合，温度37℃，反应30 min。然后用洗涤液清洗反应板3次，每次5 min，避光孵育20 min，每孔加入终止液100 μl终止反应。使用酶标仪在450 nm处测定，根据测定值计算出血清样本的实际含量，每个样本测定3次，平均量为相对含量。

1.4 观察指标 比较3组血清miR-146a、miR-25表达和CysC水平，观察妊娠高血压疾病患者血清miR-146a、miR-25表达和CysC水平与疾病严重程度和肾功能损害的关系及联合检测在肾功能损害方面的效能。

2 结果

2.1 3组血清miR-146a、miR-25表达和CysC水平变化 妊娠期高血压疾病组患者血清miR-146a和CysC水平明显高于正常妊娠组和健康对照组(P<0.01)，正常妊娠组又高于健康对照组(P<0.01)；而妊娠期高血压疾病患者血清miR-25表达水平明显低于正常妊娠组和健康对照组(P<0.01)，而正常妊娠组明显低于健康对照组(P<0.01)。见表1。

组别miR-146a(2-ΔΔCt)miR-25(2-ΔΔCt)CysC(mg/L)健康对照组(n=30)1.20±0.081.97±0.680.68±0.13正常妊娠组(n=45)1.47±0.12*1.49±0.43*0.87±0.18*妊娠期高血压疾病组(n=76)2.38±0.28*#1.06±0.24*#1.38±0.39*# F值496.94661.28084.451 P值0.0000.0000.000

注：与健康对照组比较，*P<0.01；与正常妊娠组比较，#P<0.01

2.2 血清miR-146a、miR-25表达和CysC水平与妊娠期高血压疾病严重程度的关系 随着妊娠期高血压疾病严重程度的增加血清miR-146a表达和CysC水平而出现明显升高(P<0.01)，而miR-25表达出现明显下降，差异有统计学意义(P<0.01)。见表2。

类别miR-146a(2-ΔΔCt)miR-25(2-ΔΔCt)CysC(mg/L)轻度(n=41)1.86±0.241.26±0.18 0.92±0.21 中度(n=22)2.41±0.22* 0.95±0.21* 1.46±0.28*重度(n=13)3.97±0.27*#0.62±0.12 *#2.70±0.35*#F值471.35383.379284.769P值0.0000.0000.000

注：与轻度比较，*P<0.01；与中度比较，#P<0.01

2.3 血清miR-146a、miR-25表达和CysC水平与妊娠高血压疾病出现肾损伤的关系 妊娠期高血压疾病患者肾功能异常组的血清miR-146a表达和CysC水平明显高于肾功能正常组(P<0.01)，而血清miR-25表达肾功能异常组明显低于肾功能正常组，差异有统计学意义(P<0.01)。见表3。

组别miR-146a(2-ΔΔCt)miR-25(2-ΔΔCt)CysC(mg/L)肾功能正常组(n=37)2.20±0.201.22±0.201.13±0.25肾功能异常组(n=39)2.55±0.260.90±0.151.62±0.34t值6.5527.9187.126P值0.0000.0000.000

2.4 妊娠期高血压基本患者血清miR-146a、miR-25表达和CysC水平相关性 妊娠高血压患者血清miR-25表达与miR-146a表达(r=-0.768，P<0.01)和CysC水平呈负相关(r=-0.812，P<0.01)，而miR-146a表达与CysC水平呈正相关(r=0.843，P<0.01)。

2.5 联合血清miR-146a，miR-25和CysC水平妊娠期高血压疾病肾功能损害的诊断效能 妊娠期高血压疾病患者血清miR-146a和miR-25表达及CysC水平在检测肾功能损害方面具有较高的灵敏度和特异性，将3个指标是否有肾功能损害在通过二元回归分析，联合指标(miR-146a+miR-25+CysC)具有明显的线性关系，得回归方程8.835 XmiR-146a-15.360miR-25+16.357CyC-13.372，并发现联合检测的曲线下面积为0.971，灵敏度为92.3%，特异度97.3%，在诊断肾功能损害方面明显优于单独miR-146a(Z=2.342，P=0.019)，miR-25(Z=2.210，P=0.034)和CysC(Z=2.919，P=0.004)，而3个指标之间的曲线下面积差异无统计学意义(P>0.05)。见表4，图1。

表4 联合血清miR-146a、miR-25和CyC水平妊娠期高血压疾病肾功能损害的诊断效能

图1 联合血清miR-146a、miR-25和CysC水平妊娠期高血压疾病肾功能损害的曲线下面积

3 讨论

妊娠期高血压疾病主要以高血压和蛋白尿为临床表现，其发病机制仍不清楚，高血压最早易受攻击的靶器官是肾脏，现有研究认为妊娠期高血压时，全身血管广泛痉挛，导致血流动力学发生改变，出现内皮细胞受到损伤，肾血管痉挛，肾脏血流量明显降低，肾小球滤过率明显降低，出现血清肌酐升高，出现肾功能受到损害[9]。临床上诊断肾功能损伤的指标是血清肌酐，但其浓度受到多种因素的影响，对肾小球的损伤并不特别敏感，尤其轻度受到损伤，血清肌酐仍在正常范围。本研究发现妊娠期高血压疾病患者血清CysC水平明显高于正常妊娠组和健康对照组，并且随着妊娠期高血压疾病严重程度升高而升高，说明CysC与妊娠期高血压疾病的发生发展具有一定的关系，同时本研究还显示CysC水平在肾功能异常组明显肾功能正常组，并其通过受试者曲线分析发现当血清浓度>1.29 mg/L，其灵敏度为87.2%，特异性为81.1%，说明CysC能够明显反映妊娠期高血压患者肾功能的损害程度，与文献报道[9，10]一致。CysC是一种碱性的小分子蛋白质，共120个氨基酸，在体内浓度十分稳定，不受饮食，机体炎性和肿瘤等其他因素的影响[11]。而肾脏是清除CysC的唯一器官，并且其浓度与肾小球滤过率密切相关，与肾脏损伤程度呈正相关，现已经运用监测早期肾功能损伤，有助于早期做出干预措施，防止并发症的发生。

本研究发现，妊娠期高血压疾病患者血清miR-146a表达水平明显高于正常妊娠组，并且随着疾病严重程度的增加而增加，说明基因miR-146a参与了妊娠期高血压疾病的发病过程。同时本组研究发现肾功能损害患者血清miR-146a水平明显高于肾功能正常患者，说明miR-146a参与了肾脏损伤的过程，本组研究发现当血清相对表达量2.32时，在诊断肾功能损害方面具有较高灵敏度和特异性。miR-146a定位人类染色体5q34位点上，是一种多靶向基因调节器[12]。现有研究证实其参与了动脉粥样硬化疾病的发生发展过程，是急性冠脉综合征的重要危险因素，是评价动脉粥样硬化程度的重要指标，是急性冠脉综合征病情评估的指标[13，14]。有研究显示miR-146a参与了糖尿病肾病的发生发展过程，与参与了炎性反应和肾脏氧化应激损伤，是反映肾脏功能损害的有用指标[15]。

本研究还发现妊娠期高血压患者血清miR-25表达水平明显低于正常妊娠组和健康对照组，并且与妊娠期高血压疾病严重程度呈负相关，说明miR-25是妊娠高血压疾病的保护因子，参与了疾病的发生发展过程。本研究还发现肾功能异常的妊娠期高血压疾病患者血清miR-25表达水平明显低于肾功能正常组，在预测肾功能异常方面具有较高的特异性和灵敏度。现已知miR-25是属于miR-106 b-25家族，定位于7 q22.1染色体上，维持蛋白7基因内含子上。有研究证实miR-25在肿瘤组织中具有明显表达，并在不同的肿瘤具有不同的功能[16]，而糖尿病合并肾脏损伤方面的研究发现miR-25主要通过对丝裂原活化蛋白激酶激酶4进行调控，从而达到对糖尿病肾病纤维化具有明显的抑制作用[17]，而在妊娠期高血压合并肾脏损伤方面未见报道。本研究发现miR-25表达与miR-146a表达和CysC水平呈负相关，而miR-146a表达与CysC水平呈正相关，说明miR-25和miR-146a与CysC具有一定的联系，而miR-25与miR-146a呈负相关，可能内在存在某种平衡其具体引起妊娠高血压肾脏损伤的机制需要进一步研究。本研究发现通过3个指标是否有肾功能损害在通过二元回归分析，发现联合指标具有明显的线性关系，并发现联合检测的曲线下面积为0.971，灵敏度为92.3%，特异度为97.3%，在诊断肾功能损害方面明显优于单独miR-146a、miR-25和CysC，而3个指标之间的曲线下面积差异无统计学意义(P>0.05)，说明3个指标在检测妊娠期高血压肾病方面具有一定的特异性和灵敏度，联合检测能够进一步提高其灵敏度和特异性，并且其曲线下的面积进一步提高，当妊娠高血压患者血清相对表达量miR-146a>2.32和CysC>1.29 mg/L而miR-25≤1.02时，患者在诊断妊娠高血压合并肾功能损害具有较高的特异性和灵敏度，对这些患者早期采取干预措施，进而降低妊娠高血压疾病患者的不良预后。

综上所述，miR-146a和miR-25参与了妊娠期高血压疾病的发生发展，联合检测miR-146a、miR-25和CysC水平在预测妊娠期高血压疾病患者肾功能损害具有重要的临床价值。