MiR-767和CYLD在皮肤恶性黑色素瘤中的表达和意义

张馨月 高西 许飏

皮肤恶性黑色素瘤(cutaneous malignant melanoma，CMM)是皮肤科常见的一种起源于外胚层神经嵴皮肤黑色素细胞的恶性肿瘤，易发生转移，复发率和病死率较高，预后较差[1]。CMM在不同国家、地区及人种中的发病率有较大差异，其与恶性黑色素瘤(malignant melanoma，MM)家族史、紫外线照射、创伤等具有较大关系。有报道显示，CMM发病率占皮肤恶性肿瘤的5%左右，但占MM的90%，在皮肤恶性肿瘤中病死率最高，其病死率和发病率每年呈上升趋势，且对传统的化疗、放疗等治疗手段不敏感，因此，寻找CMM治疗新靶点成为现代医学研究的热点及难度[2,3]。微小RNA(microRNA，MiRNA)是当今分子生物医学研究的热点，与多种疾病的发生发展有关，但关于MiR-767在CMM的研究还较少，圆柱瘤基因(CYLD)是一种抑癌基因，具有去泛素化酶作用，在肿瘤疾病中能够通过对核因子-κB(NF-κB)、JNK等信号通道参与肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭、迁移等过程[4,5]。因此，本研究旨在探讨MiR-767和CYLD在CMM中的表达情况及其临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2012年7月至2013年10月重庆医科大学附属大学城医院和西南医科大学附属医院病理确诊的CMM患者45例，采集患者肿瘤组织及其配对的瘤旁正常组织进行研究。其中男28例，女17例；年龄32～68岁，平均年龄(51.37±5.53)岁；按照AJCC中CMM TNM分期标准：Ⅰ期7例，Ⅱ期13例，Ⅲ期19例，Ⅳ期6例；有淋巴结转移15例，无淋巴结转移30例。本研究经重庆医科大学附属大学城医院伦理委员会批准。

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准：①经组织病理学确诊为CMM；②患者年龄≥18岁；③患者对本研究知情，自愿参与并签署知情同意书。

1.2.2 排除标准：①入组前有手术、放化疗、免疫治疗史者；②合并糖尿病、高血压等严重慢性疾病者；③合并其他恶性肿瘤者；④多方面确诊预测生存期<3个月者；⑤妊娠期或哺乳期患者；⑥合并血液性疾病及免疫抑制性疾病者。

1.3 样本收集 收集患者术后切除的肿瘤组织及对应的瘤旁正常组织，无菌0.9%氯化钠溶液清漂洗残留血迹，液氮保存，再转入-80℃超低温冰箱保存备用。

1.4 试剂与仪器 Trizol试剂购自美国Invitrogen公司，氯仿、异丙醇、无水乙醇购自晶美生物工程有限公司，反转录试剂盒、Ultra SYBR Mixture购自北京康为生物科技有限公司，MyCycler PCR仪购自美国BIORAD公司，实时荧光定量RT-PCR(Light Cycler)购自美国罗氏公司，紫外凝胶成像分析系统购自美国GENE公司，PCR引物由上海生工公司合成。

1.5 检测方法

1.5.1 总RNA提取：取组织样本加液氮研磨至粉末置于离心管中，加入Trizol (每50～100毫克样本加Trizol 100 ml)，提取RNA，实验步骤按照试剂盒说明书执行，采用紫外分光光度计检测浓度及纯度，RNA纯度高，无降解、无DNA污染方可用于cDNA合成。

1.5.2 逆转录合成:冰上配制，反应体系为：10×g DNA Eraser Buffer 1 μl，gDNA Eraser 0.5 μl，RNA 模板 1.5 μl，RNase -free ddH2O 8 μl，漩涡混合器混匀，放入金属浴中65℃预热5 min，短暂离心，冰上冷却加入：HiFiScript 10 μl，Prime Mix 1 μl，5×ScriptRT Buffer 4 μl，RNase RNase -free ddH2O 4 μl，PCR反应条件：42℃，40 min；85℃，5 min；引物-20℃保持备用。

1.5.3 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测:以U6、GAPDH做内参基因，以逆转录合成cDNA为模板，反应体系：2×Ultra SYBR Mixture 7.5 μl，cDNA 1 μl，Forward Priner 0.31 μl，Reverse Priner 0.3 μl，RNase -free ddH2O 5.9 μl，反应总体积15 μl，做3个重复，反应条件：95℃预变性,10 min；95℃变形，15 s；60℃退火，1 min；50个循环，72℃，30 s。进行PCR扩增，采用2-CT方法计算 MiR-767和CYLD的相对定量。见表1。

表1 qRT-PCR扩增引物序列

2 结果

2.1 MiR-767和CYLD表达水平比较 肿瘤组织中MiR-767表达水平明显高于瘤旁正常组织(P<0.05)，CYLD表达水平显著低于瘤旁正常组织(P<0.05)。见表2。

2.2 CMM中MiR-767和CYLD表达与临床病理特征之间关系 以CMM中MiR-767和CYLD表达的中位数(3.28,0.41)为界值将CMM患者分成MiR-767高表达组(n=24)、低表达组(n=21)，CYLD高表达组(n=18)、低表达组(n=27)。MiR-767表达与性别差异无统计学意义(P>0.05)，与肿瘤分期、淋巴结转移、肿瘤厚度密切相关(P<0.05)，CYLD表达与性别、肿瘤分期差异无统计学意义(P>0.05)，与淋巴结转移、肿瘤厚度密切相关(P<0.05)。见表3。

组别MiR-767CYLD瘤旁正常组织0.86±0.280.73±0.22肿瘤组织 5.37±0.520.11±0.06t值51.22618.239P值<0.001<0.001

表3 CMM中MiR-767和CYLD表达与临床病理特征之间关系 例

2.3 MiR-767与CYLD表达相关性 随着CMM肿瘤组织中MiR-767表达水平升高，CYLD表达呈明显降低趋势，MiR-767与CYLD表达呈负相关(r=0.791，P<0.001)。见图1。

图1 MiR-767与CYLD表达相关性

2.4 CMM Kaplan-Meier生存分析 MiR-767高表达组预后5年存活率为12.50%，MiR-767低表达组预后5年存活率为33.33%，MiR-767高表达组存活率显著低于低表达组存活率，2组比较差异有统计学意义(χ2=4.690，P=0.030)。CYLD高表达组预后5年存活率为38.89%，CYLD低表达组预后5年存活率为14.81%，CYLD高表达组存活率显著高于低表达组存活率，2组比较差异有统计学意义(χ2=4.072，P=0.044)。见图2、3。

图2 MiR-767高表达组与低表达组生存曲线比较

图3 CYLD高表达组与低表达组生存曲线比较

2.5 CMM预后的多因素回归分析 经COX多因素分析显示，性别对CMM患者预后无明显影响(P>0.05)；肿瘤分级、淋巴结转移、肿瘤厚度、MiR-767是影响CMM患者预后的危险因素(P<0.05)，CYLD是影响CMM患者预后的保护因素(P<0.05)。见表4。

表4 影响CMM预后的多因素回归分析

3 讨论

随着人们生活习惯、环境等的改变，CMM已成为中国发病率增殖最快的恶性肿瘤之一，对同时也是侵袭性最快的皮肤恶性肿瘤，对机体任何器官几乎都能够进行侵袭[6]。CMM的多发部位为头面部、背部、四肢及肢端等部位，CMM早期主要症状为黑色素痣快速变大、边缘界限不明显、颜色不均匀、瘙痒等，早期易被当做黑色素痣不被重视，早期发现经手术及放化疗治愈率可达90%～95%，但一旦发展到晚期出现淋巴结转移、卫星灶等治愈率较低，有调查显示中国CMM患者5年生存率低于20%[7,8]。因此，寻求CMM治疗的新靶点成为提高CMM患者生存率的关键。

miRNA是一类高度保守的非编码小分子RNA，研究发现1%～3%的miRNA基因组可对人类高达30%的基因进行调控，已成为现代生物学研究的热点。miRNA主要通过对信使RNA(mRNA)翻译干扰来调控下游相关靶基因表达，已有研究证实miRNA与早期胚胎发育、细胞增殖和分化、肿瘤细胞侵袭与转移、细胞凋亡、血管生成、炎症过程等都有密切联系[9,10]。Yang等[11]研究发现，miR-124能够通过抑制多功能蛋白聚糖抑制黑色素瘤细胞增殖、侵袭及迁移。陈瑶等[12-14]研究显示，miR-25在MM患者肿瘤组织中表达上调，并通过调控下游靶基因促进黑色素细胞增殖及侵袭。本研究结果显示，CMM肿瘤组织中MiR-767表达水平明显高于瘤旁组织，CYLD表达水平显著低于瘤旁组织这与Zhang等[15]研究基本相一致，表明CMM患者肿瘤组织中MiR-767表达上调，CYLD表达下调。经病理特征之间的关系比较发现，MiR-767表达与性别无明显关系，与肿瘤分期、淋巴结转移、肿瘤厚度关系密切，CYLD表达与性别、肿瘤分期无明显关系，与淋巴结转移、肿瘤厚度密切相关。说明MiR-767与CYLD可能参与CMM肿瘤细胞增殖、迁移的过程，同时有可能成为CMM治疗的新靶点。通过Pearson相关性分析显示，随着CMM肿瘤组织中MiR-767表达水平升高，CYLD表达呈明显降低趋势，MiR-767与CYLD表达呈负相关。说明在CMM患者体内MiR-767高表达能够抑制CYLD基因表达，引起患者发病。CYLD是新发现的一种肿瘤抑制基因，在多种肿瘤细胞中低表达，CYLD去泛素化活性能够对NF-κB、WNT/β-catenin、JNK等信号通路发挥负向调控作用，在调控细胞周期、细胞凋亡、炎性反应及肿瘤发生等发挥重要作用[16]。倪芳等[17]研究发现CYLD，在肝癌细胞中低表达，低表达的CYLD激活了NF-κB信号通路，肝癌细胞明显增殖。Hayashi等[18]研究表明，在乳腺癌细胞中CYLD显著降低，并且通过下调CYLD表达能够活化NF-κB信号途径来促进乳腺癌细胞转移。在CMM肿瘤细胞中，MiR-767可能是通过其表达上调抑制CYLD表达，而CYLD蛋白上存在能使κB去泛素化的结合位点，CYLD表达降低使κB去泛素化减少，而κB是NF-κB信号途径中关键抑制蛋白，因此，NF-κB信号途径被激活，引起CMM肿瘤细胞增殖及迁移。生存曲线分析显示，MiR-767高表达患者5年生存率低于低表达患者，CYLD高表达患者5年生存率高于低表达患者，说明可通过对MiR-767与CYLD表达水平检测判定CMM患者预后情况。经COX多因素分析显示，性别对CMM患者预后无明显影响；肿瘤分期、淋巴结转移、肿瘤厚度、MiR-767是影响CMM患者预后的危险因素，CYLD是影响CMM患者预后的保护因素，提示可通过对MiR-767与CYLD靶向治疗延长CMM患者预后生存时间。

综上所述，本研究通过对CMM肿瘤组织中MiR-767和CYLD水平检测显示，CMM患者肿瘤组织中MiR-767表达上调，CYLD表达下调，与肿瘤侵袭、转移关系密切，MiR-767与CYLD表达呈负相关，为CMM患者靶向治疗提供新思路，同时可作为CMM预后潜在的检测指标。